Name: عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: تعلم طريقة الالتصاق الثانوي لعزل خلايا البلاعم أحادية النوى من نخاع عظام الفئران. تتيح هذه التقنية الحصول على نموذج خلوي مستقر لدراسة تمايز الخلايا العظمية وعلم الأحياء الخلوي في المختبر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (رقم المنحة. LY19H060001) ومشروع خطة تشجيانغ للعلوم والتكنولوجيا الصينية التقليدية (رقم 2022ZB093).

أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية للتجارب على الحيوانات الصادرة عن مركز البحوث الحيوانية المختبرية بجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (رقم الموافقة: IACUC-20181029-11).
1. استخراج الخلايا
<ol><li>ضع فئران Sprague-Dawley (فئران SD ، عمرها 1-10 أيام ، ذكورا أو إناثا) في أقفاص القتل الرحيم المليئة بثاني أكسيد الكربون2 بمعدل متوازن يتراوح بين 30٪ و 70٪ من حجم الحاوية / الدقيقة. بعد أن تفقد الفئران وعيها (20-60 دقيقة) ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم لضمان موت غير مؤلم.</li>
	<li>اغمر الفئران في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق للتطهير.</li>
	<li>قم بإزالة جميع أطراف الفئران بعناية باستخدام المقص والملقط ، وقم بالشفط باستخدام PBS باستخدام ماصة واغسل الدم الملتصق بالأطراف.</li>
	<li>أضف 5 مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين إلى 500 مل من DMEM واخلطه جيدا. خذ أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل ، وأضف 5 مل من FBS و 45 مل من وسط DMEM ، واخلطه جيدا للحصول على 10٪ FBS DMEM يحتوي على محلول البنسلين / الستربتومايسين بنسبة 1٪. أضف 2 مل من وسط الثقافة أعلاه إلى أنبوب 5 مل.</li>
	<li>انقل عظام الأطراف إلى أنبوب 5 مل. استخدم المقص لقطع عظام الأطراف في الأنبوب إلى قطع صغيرة (1-3 مم) وخلط المتجانس لإعادة تعليق خلايا نخاع العظم في وسط الزرع. قف لمدة 5 دقائق حتى تستقر شظايا الأنسجة في قاع الأنبوب.</li>
	<li>أضف 10 مل من 10٪ FBS DMEM إلى طبق استزراع 100 مم، ثم انقل السوبرناتانت إلى طبق الثقافة. عند شفط السوبرناتانت ، تجنب نقل حطام الأنسجة إلى طبق الثقافة.</li>
	<li>احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة تقريبا. بعد وقت الحضانة هذا ، سوف تلتصق غالبية الخلايا الجذعية الوسيطة بجدار طبق الاستزراع وتنمو ببطء ، في حين أن معظم BMMs ستظل معلقة في وسط الاستزراع.</li>
	<li>انقل تعليق الخلية في طبق الاستزراع 100 مم إلى قارورة جديدةبحجم 25 سم 2 واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة إضافية. قم بإزالة الوسط القديم بعناية واستبدله بوسط جديد بعد التصاق BMMs بجدار القارورة.</li>
	<li>الثقافة الفرعية عندما وصلت الخلايا الموجودة في القارورة إلى 80٪ -90٪ من التقاء. ملاحظة: تم استزراع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. خلال الثقافة ، تم توحيد مورفولوجيا الخلية تدريجيا. كانت الخلايا كبيرة ، غير منتظمة الشكل ، تنمو شعاعيا وتعلق على القارورة في شكل قرص ، حيث يمكن ملاحظة نوى متعددة.</li>
</ol>2. تلطيخ FACS للخلية
<ol><li>هضم التربسين باستخدام 1-2 مل من التربسين التجاري عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق وعد الخلايا الملتصقة الثانوية لضمان عدد الخلايا النهائي من 100000 / عينة (عد الخلايا مع مقياس الدم Neubauer).</li>
	<li>قسم الخلايا إلى ثلاث مجموعات (500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100000 خلية): (1) المجموعة الضابطة الفارغة التي تحتوي على خلايا غير ملطخة. (2) المجموعة الضابطة المتساوية النمط ؛ و (3) المجموعة التجريبية (تلطيخ CD11b/c).</li>
	<li>احتضان الأجسام المضادة الأولية (لا يوجد جسم مضاد لمجموعة التحكم الفارغة ؛ التحكم في النمط المتماثل المضاد CD11 لمجموعة التحكم في النمط المتماثل ، 0.6 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1 ميكروغرام / عينة ؛ مضاد CD11b / c للمجموعة التجريبية ، 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1 ميكروغرام / عينة) على الجليد لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي في 300-350 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الخلايا مع 500 ميكرولتر من PBS. كرر الإجراء أعلاه مرة واحدة للتأكد من غسل الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة.</li>
	<li>احتضان الجسم المضاد الثانوي المقابل (لا يوجد جسم مضاد لمجموعة التحكم الفارغة ؛ الماعز المضاد للأرانب IgG للتحكم في النمط المتماثل والمجموعات التجريبية ، 0.25 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1: 2000) على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي في 300-350 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الخلايا مع 500 ميكرولتر من PBS. كرر الإجراء المذكور أعلاه مرة واحدة للتأكد من غسل الأجسام المضادة الثانية غير المقيدة.</li>
	<li>الكشف عن الخلايا الإيجابية CD11b / c عن طريق قياس التدفق الخلوي (10000 خلية / عينة) وتحليل البيانات عن طريق البرنامج (على سبيل المثال ، FlowJo 7.5). ملاحظة: للحصول على النسبة المئوية النهائية لخلايا CD11b/c+ ، تم استخدام الصيغة التالية: النسبة المئوية لخلايا CD11b / c + في المجموعة التجريبية - النسبة المئوية لخلايا CD11 + في المجموعة الضابطة isotype.</li>
</ol>3. رايت جيمسا تلطيخ
<ol><li>زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على صفائح تسلق الخلايا 35 مم 2 (1 × 106 خلايا / بئر) وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>تخلص من وسط الثقافة واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.</li>
	<li>أضف محلول صبغة Wright-Giemsa (0.5 مل - 0.8 مل) إلى ورقة تسلق الخلية لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>امزج الصبغة بالماء المقطر (0.5 مل-0.8 مل) مع قطعة قطن ، والوقوف لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>اغسل محلول الصبغة بالماء المقطر ، ثم جففه لمدة 1-3 دقائق. مراقبة تحت المجهر.</li>
</ol>4. فخ تلطيخ
<ol><li>زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على صفائح تسلق الخلايا 35 مم 2 (1 × 106 خلايا / بئر) وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>استبدل الوسط القديم ب 10٪ FBS DMEM أو وسيط تحريض osteoclast مكمل بمنشط مستقبلات 50 نانوغرام / مل من رباط العامل النووي κB (RANKL) و 30 نانوغرام / مل من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، والاستزراع عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 7 أيام إضافية.</li>
	<li>قم بتلطيخ الخلايا باستخدام مجموعة تلطيخ TRAP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وراقبها تحت المجهر. ملاحظة: تم تعريف الخلايا الإيجابية TRAP على أنها الخلايا العظمية ، والتي كانت أرجوانية تحت المجهر الضوئي. تم قياس عدد الخلايا الموجبة TRAP باستخدام برنامج ImageJ.</li>
</ol>5. لطخة غربية
<ol><li>زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على 35 مم2 أوراق تسلق الخلايا (1 × 106 خلايا / بئر) وزرع لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>استبدل الوسط القديم ب 10٪ FBS DMEM أو وسيط تحريض osteoclast (50 نانوغرام / مل من RANKL و 30 نانوغرام / مل من M-CSF) والاستزراع لمدة 7 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>استخراج البروتينات الخلوية الكلية مع المخزن المؤقت RIPA ، منفصلة بنسبة 10 ٪ SDS-PAGE ، ونقلها إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين18,19.</li>
	<li>يوضع المزيج مع 5٪ من مسحوق الحليب الخالي من الدسم (25 مل) لمدة 2 ساعة ويغسل ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة ، باستخدام TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>احتضن الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (مضاد β-أكتين ، مضاد TRAP ، ومضاد للكاثيبسين K ؛ تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية 1: 1000 ، 10 مل من الأجسام المضادة المخففة / الشريط) ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام TBST.</li>
	<li>احتضان الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للأرانب IgG ، تخفيف 1: 2000 ، 10 مل من الأجسام المضادة المخففة / الشريط) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، وغسل ثلاث مرات مع TBST. تصور نطاقات البروتين باستخدام حل متطور. ملاحظة: تم تطبيع مستويات التعبير عن البروتينات المذكورة أعلاه إلى β الأكتين.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

الخلايا العظمية هي واحدة من أهم أنواع الخلايا المشاركة في حدوث وتطور أمراض العظام ، وكذلك واحدة من الأشياء الأساسية لأبحاث أمراض العظام20. يمكن أن تتمايز الخلايا الأحادية / البلاعم إلى خلايا عظمية. نظرا لأن البلاعم أحادية النواة (خلايا RAW264.7) مكلفة للغاية ويمكن تنشيطها بسهولة أثناء الزراعة ، فمن الصعب إجراء تجارب تمايز في المختبر باستخدام خط الخلايا هذا. على الرغم من أنه تم تطوير عدة طرق لاستخراج الخلايا الوحيدة / البلاعم من نخاع العظام ، بما في ذلك الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، وهضم ا...

وقد أفيد أن خلايا سلالة البلاعم الأحادية الموجودة في نخاع العظم يمكن أن تتمايز إلى خلايا وحيدة الدم والبلاعم النسيجية 1,2. تستخدم الخلايا المذكورة أعلاه ، والتي يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية لتحقيق التوازن بين نمو العظام وتطورها ، كنموذج خلوي لحث الخلايا على الخلايا العظمية في الجسم الحي 3,4. نخاع العظم هو نسيج خاص يحتوي على عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، وخلايا البلاعم أحادية الخلايا (BMMs) ، والخلايا الجذعية المكونة للدم ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية. في الواقع ، أشارت العديد من الدراسات السابقة إلى أن الخلايا الملتصقة التي خرجت من تجويف نخاع العظم للعظم الطويل يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية أو خلايا عظمية أو خلايا غضروفية أو خلايا دهنية5،6،7،8. على الرغم من استخدام طرق عزل وزراعة مختلفة لإنتاج مجموعات خلايا متجانسة مختلفة ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات كبيرة في عزل وزراعة BMMs من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة.
تم تطوير عدة طرق لاستخراج البلاعم أحادية النواة في نخاع العظم (BMSCs). ومع ذلك ، فإن غالبية هذه الطرق معقدة9،10،11. على سبيل المثال ، يتطلب الطرد المركزي لتدرج الكثافة مجموعة متخصصة وتستغرق العملية وقتا طويلا ومرهقة. هذه الطريقة مناسبة لعزل BMMs من عينات الدم كبيرة الحجم ، ولكن ليس من عينات نخاع العظم9،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخراج عينات الأنسجة باستخدام هضم الكولاجيناز هو إجراء معقد ويستغرق وقتا طويلا. لا ينصح بهذه الطريقة لعزل BMMs من عينات نخاع العظم14,15. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن فصل التدفق يمكن أن يؤدي إلى مجموعات أحادية / بلاعم عالية النقاء ، إلا أنه يتطلب أحجام عينات كبيرة جدا ومتطلبات عالية من الأدوات والمعدات10,16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة إثراء الميكروبيدات مكلفة للغاية وغير مجدية في مختبر عام17.
لذلك ، في الدراسة الحالية تم اقتراح طريقة مريحة وسريعة ورخيصة لعزل البلاعم أحادية النواة عن نخاع العظام. تم استخدام خلايا نخاع العظم الملتصقة بنقاط زمنية مختلفة لعزل BMMs باستخدام طريقة الالتصاق الثانوية. يمكن أن تحفز BMMs المستخرجة بالطريقة المذكورة أعلاه على تكوين الخلايا العظمية في المختبر ، وبالتالي توفير نموذج خلية بسيط ومريح للدراسة المستقبلية لهشاشة العظام في المختبر.

<table><tbody><tr><td>35 مم < سوب > 2 < / سوپ > شرائح تسلق الخلايا</td><td>NEST التكنولوجيا الحيوية</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>مكافحة القسطرة K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1: 1،000</td></tr><tr><td>التحكم في النمط المتشاوي المضاد ل CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 & mu ؛ ز / اختبار ، 1.675 مجم / مل</td></tr><tr><td>مضاد CD11b / ج</td><td>أبسين</td><td>ABS124232</td> <td>&nbsp ؛ 1 & مو ؛ ز / اختبار ، 1 مجم / مل</td></tr><tr><td>مضاد للفخ</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1: 1،000</td></tr><tr><td>مضاد بيتا ؛ أكتين</td><td>Beyotime</td> <td>&nbsp ؛ AF5003</td><td>1: 1,000</td></tr><tr><td>شرائح تسلق الخلايا</td><td>NEST التكنولوجيا الحيوية</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>طبق زراعة الخلايا</td><td></td><td>corning 430167</td><td></td></tr><tr><td>قارورة زراعة الخلايا</td><td></td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)</td><td>جيبكو</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>مصل بقري الجنين (FBS)</td><td>جيبكو</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضادة للأرانب IgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>ل IF ، 1: 2,000</td></tr><tr><td>الماعز المضادة للأرانب IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>ل WB ، 1: 2,000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD الفئران</td><td>شنغهاي SLAC مختبر المحدودة</td><td></td><td>1-10 أيام</td></tr><tr><td>مجموعة تحضير جل SDS-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP / ALP طقم تلطيخ</td><td>واكو</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>حل التربسين-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>حل رايت-جيمسا</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

مع انخفاض كثافة المعادن في العظام ، تكون العظام أكثر عرضة للكسر ، مما يؤثر سلبا على نوعية حياة المريض. يتم تنظيم نمو وتطور العظام بشكل رئيسي بواسطة الخلايا العظمية والخلايا الآكلة للعظام. وقد تم قبوله على نطاق واسع أن الخلايا العظمية الخلية مشتقة من خلايا البلاعم وحيدة الخلايا العظمية (BMMs). توجد BMMs وغيرها من الخلايا الجذعية المكونة للدم في تجويف نخاع العظام. لذلك ، فإن عزل BMMs المستقرة الواحدة من مجموعات الخلايا المختلفة وغير المتجانسة يمثل تحديا كبيرا. هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية. تم جمع الخلايا الملتصقة المستزرعة لمدة 24-48 ساعة في الثقافة الأولية. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 37.94٪ من الخلايا كانت CD11b / c + (مستضد سطح البلاعم الأحادي). أظهر تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) وتحليل اللطخة الغربية أن BMMs يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية في المختبر. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أنه يمكن اعتبار خلايا الالتصاق الثانوية نموذجا خلويا مناسبا لأبحاث تمايز الخلايا العظمية.

كان عدد الخلايا الملتصقة الثانوية مستقرا وموحدا. مع الانتشار المستمر للخلايا ، أصبحت غالبية الخلايا أكبر ، مع شكل غير منتظم ونمت لتصبح قرصا ملتصقا شعاعيا (الشكل 2C ، D). أظهر قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن CD11b / c ، وهي علامة جزيئية على سطح خلايا سلالة البلاعم الأحادية ، كانت حوالي 37.94٪ (الشكل 2A ، B). لمزيد من التحقق من أن الخلايا الإيجابية CD11b / c كانت خلايا سلا...

هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية.

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

في هذا البروتوكول ، يتم استخراج خلايا البلاعم أحادية الخلية العظمية عن طريق طريقة الالتزام الثانوية. يمكن لخلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم أن تتمايز بنجاح إلى خلايا عظمية ، مما يوفر نموذجا مستقرا للخلايا لدراسة الخلايا العظمية في المختبر. هذه الطريقة مناسبة لعينات نخاع العظم الصغيرة ويمكنها استخراج خلايا البلاعم أحادية الخلية العظمية من نخاع العظم ببساطة وسرعة دون الحاجة إلى معدات مختبرية عالية التقنية.قد تكون زيادة الخلايا الآكلة للعظام هي التسبب المحتمل لهشاشة العظام. خلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم لها قيمة بحثية معينة كخلايا سلائف عظمية البلاستيد. للبدء ، اغمر الفئران الرحيمة في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق للتطهير.بعد إزالة جميع أطراف الفئران بعناية باستخدام المقص والملقط ، قم بالشفط باستخدام PBS باستخدام ماصة واغسل الدم الملتصق بالأطراف. ثم في اثنين من ملليلتر من 10٪ FBS DMEM في أنبوب خمسة ملليلتر. بعد نقل عظام الأطراف إلى أنبوب خمسة ملليلترات ، استخدم المقص لقطع عظام الأطراف في الأنبوب إلى قطع صغيرة وخلط المتجانسة لإعادة تعليق خلايا نخاع العظم في وسط الزرع.قف لمدة خمس دقائق حتى تستقر شظايا الأنسجة في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من 10٪ FBS DMEM إلى طبق ثقافة 100 ملم ، ثم انقل supernatant إلى طبق الثقافة. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة تقريبا.بعد وقت الحضانة هذا ، ستلتصق غالبية الخلايا الجذعية الوسيطة بجدار طبق المزرعة وتنمو ببطء ، في حين أن معظم خلايا البلاعم أحادية الخلايا العظمية ستظل معلقة في وسط الزرع. انقل تعليق الخلية في طبق الاستزراع 100 ملم إلى قارورة جديدة مساحتها 25 سم مربع واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة إضافية. بعد إزالة الوسط القديم بعناية ، استبدله بوسط جديد بعد أن تلتصق خلايا البلاعم أحادية الخلايا العظمية بجدار القارورة.أظهر قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن CD11b و c ، وهي علامة جزيئية على سطح خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية كانت حوالي 37.94٪ مع الانتشار المستمر للخلايا ، أصبحت غالبية الخلايا أكبر ضمن شكل غير منتظم ونمت لتصبح قرصا لاصقا شعاعيا. أظهرت نتائج وصمة عار TRAP أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، زاد عدد الحبيبات الحمراء الأرجوانية داخل الخلايا بشكل كبير في الخلايا المستحثة بمنشط مستقبلات العامل النووي kappa B ligand وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن مستويات التعبير عن البروتينات المحددة للعظم TRAP والكاثيبسين K قد زادت بشكل كبير في الخلايا المعالجة مقارنة بالمجموعة الضابطة.أهم شيء في هذا الإجراء هو الوقت المناسب لجمع الخلايا الملتصقة الثانوية في غضون 24 إلى 48 ساعة من الثقافة الأولية ، تبدأ خلايا البلاعم أحادية الخلايا في نخاع العظم في الالتصاق تماما. يمكن تحفيز الخلايا أحادية الخلية العظمية المعزولة بهذه الطريقة في الخلايا العظمية في المختبر ، مما يوفر نموذجا مستقرا للخلايا لدراسة هشاشة العظام.

isolation-monocyte-macrophage-lineage-cells-from-rat-bones-secondary

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

تم وصف أسلوب الرواية للحصول على الضامة من الثقافة الأساسية للخلايا كبد الفئران. هذا الأسلوب يستخدم انتشار الضامة في الثقافة ، تليها اهتزاز قوارير الثقافة وتنقية عن طريق الحجز الانتقائي لأطباق بلاستيكية. هذا الأسلوب يوفر كفاءة الضامة الكبد بدون معدات معقدة والمهارات.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلية لتجارب لاحقة.

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

نقدم هنا بروتوكولا يولد كميات كبيرة من الخلايا الوحيدة الفئران من نخاع العظام غير المتجانسة للتطبيقات الانتقالية. بالمقارنة مع الآخرين ، تساعد هذه الطريقة الجديدة في تقليل عدد المضحية بها وخفض التكاليف عن طريق تجنب الطرق باهظة الثمن مثل فصل الخلايا المغناطيسية عالية التدرج (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

يصف هذا البروتوكول تقنية العزل للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الأولية من الفئران، من خلال استخدام الهضم الأنزيمي، كثافة الفصل المتدرج، والتقيد البلاستيك وCD146 + اختيار حبة المغناطيسي.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

العظم والعظام هي الانسجه الخاصة الضامة الكريات العظمية المشتقة من سلاله أحاديه الضامة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم. يصف هذا البروتوكول كيفيه عزل خلايا نخاع العظم بحيث يتم الحصول علي كميات كبيره من العظم العظمي مع الحد من مخاطر الحوادث الموجودة في الطرق التقليدية.

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

تقدم هذه المقالة طريقة تجمع بين الالتزام بنخاع العظم بالكامل وفرز قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية من الفك السفلي للفئران وزراعةها وفرزها وتحديدها.

عزل وزراعة الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية النخاعية في الفئران

هنا هو بروتوكول لإلحاق CD47 الببتيد (pepCD47) إلى الدعامات المعدنية باستخدام الكيمياء polybisphosphonate. وظيفية من الدعامات المعدنية باستخدام pepCD47 يمنع المرفق وتفعيل الخلايا الالتهابية وبالتالي تحسين التوافق الحيوي.

التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد

يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران.

عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران

يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.

نهج فريد لعزل العدلات نخاع عظم الفئران بسعة مماثلة

يصف هذا البروتوكول طريقة غير إنزيمية ومباشرة لعزل خلايا نخاع عظم الفأر الوليدي البالغة من العمر 7-9 أيام وتوليد بلاعم متباينة باستخدام طاف من خلايا L929 كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة المحببات (M-CSF). تم تحليل الضامة المشتقة من نخاع العظم بشكل أكبر للمستضدات السطحية F4 / 80 و CD206 و CD11b والكفاءة الوظيفية.

عزل نخاع عظم الفأر الوليدي وإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم

الخلايا الجذعية الوسيطة من نخاع عظم الفك لها وظائف مهمة في التمايز المتنوع والتجديد الذاتي والتعديل المناعي. لقد برزت كمستودع حاسم للخلايا السليفة في العلاج الجيني وهندسة الأنسجة والطب التجديدي. هنا ، نقدم طريقة فريدة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك في الفئران.

تقنية عزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك الجرذ

تعلم طريقة الالتصاق الثانوي لعزل خلايا البلاعم أحادية النوى من نخاع عظام الفئران. تتيح هذه التقنية الحصول على نموذج خلوي مستقر لدراسة تمايز الخلايا العظمية وعلم الأحياء الخلوي في المختبر.

عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية

استكشف المزيد من الفيديوهات