تحليل ضعف انقباض القلب و Ca²⁺ عابر في الخلايا العضلية القوارض

يكتشف هذا النهج التغيرات في وظيفة انقباض أثناء تطور قصور القلب. يمكن أيضا فحص الاستجابة الوظيفية في الخلايا العضلية للهرمونات العصبية والعوامل العلاجية المحتملة. قد يتطلب وضع الخلية العضلية ممارسة ولكنه ضروري للحصول على تصوير متسق لطول القطعة العضلية.

توضح الإجراء مارغريت ويستفول ، الأستاذ المشارك والباحث الرئيسي في المختبر. قبل البدء في التجربة ، سخن عبوة هلام ووسائط في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتشغيل مكونات منصة وظيفة الانقباض كما هو مذكور في المخطوطة وقم بتجميع الأنابيب في المضخة التمعجية.

بعد ذلك ، انقل عبوة الجل المسخنة مسبقا إلى حامل الأنبوب وقم بتشغيل الفراغ في الطاقة إلى محفز الخلية. ضع أنبوبا سعة 50 ملليلترا مع وسائط في حامل الأنبوب المعزول لبدء التروية بمعدل 0.5 ملليلتر في الدقيقة من خلال أنبوب المضخة التمعجية. بعد ذلك، أضف ملليلتر من الوسائط المسخنة مسبقا إلى قارب وزن صغير وانقل زلة غطاء واحدة تحتوي على خلايا عضلية من حجرة التحفيز إلى وعاء الوزن.

أعد غرفة التحفيز إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة زلة الغطاء من قارب الوزن وامسح الجانب السفلي برفق قبل نقله إلى حجرة انزلاق الغطاء المدهونة حديثا وإضافة قطرة من الوسائط إلى زلة الغطاء. ضع حامل قطب كهربائي بلاتيني فوق زلة الغطاء ، ثم ضع غطاء منزلق جديد فوق الجزء العلوي بالملقط وضع حاملا علويا فوق شطيرة الغطاء المنزلقة.

قم بتركيب اثنين أو أربعة مسامير بدون رأس لإنهاء تجميع الغرفة. في المضخة التمعجية عندما تكون الوسائط موجودة في جميع أنحاء الأنبوب ، قم بتوصيل الأنبوب بالتسخين الأولي والتسخين المسبق بحجرة انزلاق الغطاء. بعد ذلك ، ابدأ التروية بمعدل 0.5 ملليلتر في الدقيقة وضع منديلا أسفل الحجرة لضمان عدم وجود تسرب.

بعد وضع حجرة انزلاق الغطاء في محول المسرح للمجهر ، قم بتشغيل نظام التسخين وموازنة التجميع لمدة خمس إلى 10 دقائق لتحقيق درجة حرارة وسائط ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية في وسط الغرفة. راقب الوسائط المتدفقة التي يتم جمعها في الطرف المقابل من الغرفة مع توصيل الأنابيب بنظام التفريغ. خلال وقت التوازن ، تصور الخلايا العضلية بهدف غمر الماء 40x على المجهر.

لتنشيط محفز السرعة ، اضبط الجهد على 35 إلى 40 فولت واضبط تردد التحفيز على 0.2 هرتز لتحسين وظيفة الانقباض وبقاء الخلايا العضلية. لجمع آثار تقصير القطعة العضلية، افتح البرنامج على الكمبيوتر وحدد حسنا وملف وعلامات تبويب جديدة. قم بإعداد قالب شاشة عن طريق تحديد عمليات التتبع وتحرير حدود المستخدم وطول القطعة العضلية.

سجل آثار طول القطعة العضلية باستخدام الملف وعلامات التبويب الجديدة ، وحدد الخلية العضلية المنقبضة وضع الخلية العضلية على طول المحور الطولي للكاميرا بحيث يكون نمط التشقق رأسيا. استخدم فأرة الكمبيوتر لوضع المنطقة محل الاهتمام أو مربع عائد الاستثمار فوق الخلية العضلية. حدد جمع وابدأ في تسجيل وظيفة الانقباض.

سجل تقصيرا لمدة 60 ثانية من كل خلية عضلية بترددات تحفيز منخفضة تبلغ 0.5 هرتز. سجل تقصير القطعة العضلية من خمس إلى 10 خلايا لكل قسيمة غطاء. لقياس التقصير على نطاق من الترددات ، ضع الخلايا العضلية عند كل تردد للحصول على تقصير ثابت للحالة قبل التسجيل.

ضاعف معدل التروية وابدأ في التسجيل بعد 15 إلى 20 ثانية من التحفيز بتردد جديد في نطاق 0.2 إلى 2 هرتز وسجل ما لا يزيد عن خليتين عضليتين لكل انزلاق غطاء للتقصير عبر النطاق المحدد لترددات التحفيز. سجل ما لا يقل عن سبعة انقباضات لكل خلية للحصول على بيانات موثوقة في متوسط الإشارة. حدد الملف واختر تتبعا مسجلا ثم حدد فتح.

حدد علامة التبويب الأولى من تتبع القاعدة ثم قم بتعيين اللوحة الصفراء في الجزء العلوي من التتبع للحصول على طول sarc. قم بإعداد قالب تحليل مع خيارات تحليل عابرة رتيبة العمليات وعلامة حدث TTL في مربع تعريف T Zero في الخيارات الضرورية من القائمة. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب وحفظ قالب التحليل بمعرف.

قم بتحميل قالب التحليل قبل تحليل كل تتبع. لتحليل البيانات ، حدد العلامات والبوابة وأضف عابرا ثم قم بالتحويل من علامة الحدث ونطاق التحليل. اضبط النطاق الزمني من ناقص 0.01 إلى 1.20 ثانية للخلايا العضلية التي تسير بخطى 0.2 هرتز.

حدد نطاقا زمنيا أقصر للخلايا العضلية المحفزة بترددات أعلى. حدد العمليات ومتوسط الأحداث لإنتاج تسجيل متوسط إشارة أسفل تتبع القاعدة الأصلي. بعد ذلك ، حدد علامة التبويب الأولى من تتبع متوسط الإشارة ثم انتقل إلى العلامات في القائمة العلوية متبوعة بإضافة عابر ، واختر العمليات والتحليل العابر الرتيب لعرض القيم المتوسطة للإشارة لمعلمات القطعة العضلية الأساسية في لوحة عرض متوسط الإشارة.

حدد تصدير التحليل العابر الرتيب وتيار الحافظة ونقل تحليل القطعة العضلية العابرة إلى جدول بيانات للتحليل المركب للخلايا العضلية المتعددة. لنسخ متوسط تتبع الإشارة ، حدد تصدير ، التتبع الحالي ، ثم علامات تبويب الحافظة والخيارات بالترتيب واضبط المنازل العشرية على خمسة. اختر محدد علامات التبويب وانقر فوق موافق.

قم بتسريع متوسط آثار الإشارة لكل تسجيل خلية عضلية في جدول بيانات ثان. أظهرت الدراسة أن الضغط الزائد أو PO ، قلل من وظيفة انقباض الخلايا العضلية بالمقارنة مع المجموعة الوهمية. ومع ذلك ، بعد أربعة أيام من النقل الجيني للتروبونين القلبي IT 144D أو cTnIT144D ، عادت القدرة على الانقباض في الخلايا العضلية PO نحو مستويات الوهمية ، مما يشير إلى إمكانية استعادة وظيفة الخلايا العضلية.

في الدراسات الأولية ، عزز نقل الجينات ل cTnIT144D تقصير الذروة وارتفاع مستويات الكالسيوم الانبساطي مقارنة ب CTnI. غالبا ما تكون هناك حاجة إلى تعديلات دقيقة في وضع الخلية العضلية القلبية للحصول على آثار تقصير واضحة. يمكن أيضا إجراء هذا البروتوكول على الخلايا العضلية القلبية المحملة بأصباغ الفلورسنت الحساسة للكالسيوم مثل Fura-2 AM للكشف عن عابري الكالسيوم بالإضافة إلى التقصير.