شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية

لقد أنشأنا نموذجا حيوانيا صغيرا لإزالة الخلايا من أحد الأطراف. هذا مفيد لتسهيل إثبات مفهوم البحث عن de وإعادة الخلايا من الأنسجة المركبة الوعائية. نظم كبت المناعة هي واحدة من القيود الرئيسية في زرع الأوعية الدموية المركبة.

يمكن تقليل مناعة الأنسجة باستخدام إزالة الخلايا. للبدء ، قم بعمل شق جلدي باستخدام شفرة جراحية رقم 10 على طول الرباط الإربي ، والانتقال من الاتجاه الجانبي إلى الاتجاه الإنسي ، مع إمساك الجلد المحيط باستخدام Adson Forceps. عندما تتعرض الدهون الكامنة ، استخدم تشريح حاد لتشريح الدهون بعناية ، وتحديد موقع الأوعية الشرسوفية العلوية.

باستخدام المقص الدقيق ، تشريح بالقرب ، وكشف العصب الفخذي الأساسي والشريان والوريد على مستوى الرباط الإربي. تحت مجهر التشريح ، حدد الأوعية الفخذية ، وقم بتشريح الشريان والوريد عن قرب باستخدام ملقط دقيق للحصول على طول كاف من نقاط التشعب في الشبكة الشريانية. ثم ، ربط الوريد الفخذي والشريان بشكل منفصل باستخدام 6-0 الغرز.

بعد ذلك ، قم بإجراء تشريح محيطي حول ما تبقى من الطرف الخلفي دون تعطيل الأوعية الفخذية المربوطة ، وعبور عظم الفخذ في منتصف الطول باستخدام قاطع العظام. لعزل الطرف الخلفي بالكامل ، انقل الأوعية الفخذية المربوطة البعيدة إلى الأربطة باستخدام مقص دقيق ، وقم بقنية الشريان الفخذي باستخدام قسطرة وعائية قياس 24 تحت مجهر التشريح. ثم ، اغسل بمحلول ملحي هيبارين حتى يلاحظ تدفق واضح من الوريد الفخذي.

قم بتأمين القنية عن طريق ربط خياطة واحدة حول الوعاء المقنن في خياطة أخرى بعيدة حول القنية نفسها ، مما يضمن وضع القنية بالقرب من منع انسداد نقاط التشعب. بعد ذلك ، قم بغمر الأطراف الخلفية المشتراة و PBS حتى إزالة الخلايا. لبناء المفاعل الحيوي ، ضع الغرفة المعقمة ، وقم بربط ثلاثة محبس ثلاثية الاتجاهات للاستخدام مرة واحدة عند خطوط المدخل والمخرج والتجديد ، مما يضمن تغطية محبس منفذ التجديد في المنفذين المتبقيين لمنع التسرب.

قم بتوصيل أنابيب السيليكون المصنوعة مسبقا بالسدادات عند خطوط المدخل والمخرج. ثم قم بتوصيل الأنابيب التمعجية بأنابيب السيليكون. بعد تثبيت الكاسيت على الأنبوب التمعجي ، ضعه على المضخة التمعجية.

بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد أنابيب السيليكون بنهاية الأنبوب التمعجي لخط المخرج من الخطوة أعلاه. على الطرف الآخر ، قم بتوصيل ماصة مصلية سعة ملليلتر واحد ، وأعد تعليق الطرف المرفق بماصة مصلية في قارورة خزان النفايات. بعد ذلك ، قم بتعليق نهاية الأنبوب المتصل بالماصة المصلية في خزان المنظفات ، وأغلق على الفور فتحة دورق خزان المنظفات باستخدام بارافيلم.

أضف 0.25٪ SDS من الجرة الزجاجية سعة لتر واحد إلى غرفة المفاعل الحيوي عند مستوى منتصف الطريق. بعد ذلك ، خذ الطرف الخلفي الذي تم شراؤه باستخدام Adson Filess ، وقم بتعليقه في غرفة المفاعل الحيوي بعناية. باستخدام زوجين من ملقط Adson ، قم بتوجيه الجزء المقني من الطرف الخلفي إلى خط المدخل أثناء إمساك القنية بزوج واحد من الملقط.

استخدم الزوج الآخر من الملقط للف وتأمين خط المدخل إلى القنية. بمجرد تأمينه ، أضف المزيد من 0.25٪ SDS من الجرة الزجاجية سعة لتر واحد لغمر الطرف بالكامل حسب الحاجة ، مما يضمن غمر منفذ المخرج أيضا في خزان المفاعل الحيوي ، والحفاظ على التدفق الخارجي المتسق. بعد ذلك ، قم بتوصيل مرشح حقنة يستخدم مرة واحدة بمنفذ التهوية الموجود على غطاء غرفة المفاعل الحيوي ، وقم بتأمين الغطاء على المفاعل الحيوي ، مع التأكد من إغلاق الغرفة من جميع الجوانب.

لإزالة الهواء من الأنبوب وتجهيز دائرة التروية ، استخدم حقنة جديدة سعة 10 ملليلتر تستخدم مرة واحدة لسحب المنظف من خزان المنظف باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات عند خط المدخل. بمجرد السحب ، استخدم نفس السائل لإدخاله في محبس ثلاثي الاتجاهات عند خط المخرج. بعد ذلك ، اضغط لأسفل وقم بتأمين الكاسيت بالأنبوب في المضخة التمعجية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل المضخة التمعجية باستخدام زر الطاقة. على شاشة المضخة التمعجية ، انتقل إلى علامة التبويب الثانية باستخدام مفتاح السهم لتعيين معدل الإرواء للقناة الأولى مع معدل تدفق الإدخال كطريقة التسليم ، واضبط معدل الإرواء على ملليلتر واحد في الدقيقة ، مما يضمن صحة اتجاه التدفق وفقا لإعداد الجهاز. قم بمعايرة المضخة التمعجية لضمان تدفق كمية السائل التي يتم توصيلها عبر خط المدخل ، و / أو المأخوذة من خط المخرج باستمرار بين الاثنين ، مما يضمن ضبط معرف الأنبوب على 1.85 ملم.

ابدأ عملية إزالة الخلايا عن طريق التروية الآلية بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة لكل من خطوط المدخل والمخرج عن طريق الضغط على زر الطاقة على لوحة المفاتيح. مراقبة والتأكد من أن التدفق مستمر في كل من خطوط المدخل والمخرج. باستخدام 1 لتر من 0.25٪ STS ، قم بتجديد خزان المفاعل الحيوي من خلال منفذ التجديد حسب الحاجة.

بعد ذلك ، ابحث عن مظهر أبيض شفاف للأنسجة ، والذي سيظهر بحلول اليوم الخامس ، مما يشير إلى إزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران. بعد تأكيد إزالة الخلايا ، استبدل خزان المنظفات بخزان PBS و 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، وأغلق فتحة القارورة بالبارافيلم. ابدأ برنامج تلفزيوني و 1٪ تروية مضاد حيوي مضاد للبكتيريا بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة ، واستمر لمدة يومين.

استبدل خزان PBS و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات ب 200 ملليلتر من 0.1٪ حمض طفيلي ، وخزان إيثانول 4٪ ، وابدأ التروية عند ملليلتر واحد في الدقيقة لمدة ساعتين. تحت خزانة السلامة الحيوية ، افصل الطرف الخلفي عن خط المدخل باستخدام زوجين من ملقط Adson المعقم مع زوج واحد من الملقط للف خط المدخل ، والآخر يحمل القنية ، مما يضمن عدم سحب القنية لمنع التفكيك. قم بتخزين الطرف في وعاء زجاجي سعة 500 مل يحتوي على PBS ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي عند 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه مرة أخرى.

أظهر كل من الشريان الفخذي والوريد منزوع الخلايا فقدان المحتوى النووي عبر جميع الطبقات والأنسجة الضامة المحيطة ، نظرا لعدم وجود نوى زرقاء اللون موجودة في الأوعية الأصلية. تم الحفاظ على الغلالة الداخلية و adventitia لكل من الوريد الفخذي والشرايين في الأوعية منزوعة الخلايا. أظهر العصب الفخذي الحفاظ على بنية الأنسجة ، بما في ذلك باطن العصب.

أظهر العظم احتفاظا هيكليا شاملا مع فقدان النوى الملطخة للخلايا العظمية ، ومن طبقات البطانة الداخلية والسمحاق المحيطة بعد إزالة الخلايا. أظهر الجلد فقدان الخلايا من البشرة والأدمة. أظهرت الأدمة ألياف كولاجين محتفظ بها تشبه أنسجة الجلد الأصلية.

أخيرا ، أظهر المنظر المستعرض للعضلات الهيكلية فقدان النوى الموجودة في أطراف بطانة الرحم. ظل محتوى اللييفة العضلية محتفظا به داخل الحزم المعنية بعد إزالة الخلايا. كما تم إجراء قياس كمية الحمض النووي باستخدام PicoGreen ، حيث تم تقليل محتوى الحمض النووي بشكل كبير عبر الأوعية الفخذية والأعصاب والجلد والعضلات والعظام.

بعد هذا البروتوكول ، يمكن توصيف الطرف منزوع الخلايا. يتضمن ذلك فحص المصفوفة خارج الخلية باستخدام كل من الطرق النسيجية والكيميائية الحيوية ، وتقييم الأوعية الدموية باستخدام التصوير. يمكن أيضا إعادة خلية الساق منزوعة الخلايا باستخدام خلايا خاصة بالأنسجة.