الكشف عن المبيضات القابلة للنشر الميداني Liberibacter asiaticus باستخدام تضخيم بوليميراز Recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a
ديسمبر 23, 2022
في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.
هوانغ لونغ بينغ ، يختصر باسم HLB. إنه مرض حمضيات مدمر في جميع أنحاء العالم. في معظم البلدان المنتجة للحمضيات ، مثل الصين والولايات المتحدة الأمريكية ، يحدث HLB بسبب البكتيريا المقيدة باللحاء Candidatus Liberibacter asiaticus ، والمختصرة باسم CLas.
كان الكشف المبكر عن CLas مهما للمزارعين لتسهيل التدخل المبكر ومنع انتشار المرض. لذلك قمنا هنا بتطوير طريقة جديدة لتشخيص HLB السريع والمحمول ، جنبا إلى جنب مع تضخيم بوليميراز recombinase ونظام CRISPR-Cas12a. أطلقنا عليه اسم CLas-DETECTR.
حساسية منصتنا أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، فإنه يظهر نتيجة مماثلة مع qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع اكتشافات CLas التقليدية ، يمكن الانتهاء من طريقتنا في 90 دقيقة ، وتعمل في حالة متساوية الحرارة.
يمكن أيضا تصور النتيجة من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان. يحتوي CLas-DETECTR على أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، ونتائج التصور. يتم توضيح الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR هنا.
يتم إعداد المخزن المؤقت A والحل B والحل C كما هو موضح في البروتوكول. لتوفير الوقت وجعل هذه الطريقة مناسبة للكشف عن CLas الميداني ، تم استخدام النهج القائم على E.coli البولي إيثيلين جلايكول للحصول على مستخلصات نباتية خام لتضخيم الحمض النووي. تستخدم أوراق الحمضيات في الأداة.
لكمة القطع القليلة من أقراص الأوراق من ورقة. ضع أقراص الأوراق في أنبوب إيبندورف سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت أ إلى الأنبوب.
طحن أقراص ورقة حتى تصبح ناعمة مع قضيب من البلاستيك يدويا. اترك الأنبوب دون إزعاج لمدة 10 دقائق. يتم تطبيق الطافي لاحقا على تضخيم الحمض النووي.
لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، أضف ميكرولترا واحدا من المادة الطافية من الخطوة 2.3 وميكرولترا واحدا من أسيتات المغنيسيوم إلى المحلول B واخلطه جيدا. في المختبر ، احتضنهم في حاضنة بسيطة عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة. لتصور النتائج ، أضف 10 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 3.2 إلى المحلول C واخلطه جيدا.
احتضانها في حاضنة 37 درجة لمدة 60 دقيقة. ارتد نظارة واقية ، وراقب إشارة التألق الخضراء من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد. لاختبار خصوصية CLas-DETECTR ، أول مستعمرات نقية من Agrobacterium tumefaciens GV3101 ، Xanthomonas citri subsp.
تم استخدام الستري وهو العامل الممرض لقرحة الحمضيات وسلالة Burkholderia stabilis 1440 المعزولة في مختبرنا لاستخراج الحمض النووي الجينومي. ثم خضع هذا الحمض النووي الجينومي للبكتيريا الثلاثة والحمض النووي الجينومي لأوراق نيوهول الإيجابية CLas لاختبار CLas-DETECTR. لاختبار حساسية CLas-DETECTR ، تم الكشف عن سلسلة من تخفيفات شظايا الحمض النووي CLas باستخدام PCR و CLas-DETECTR و qPCR كما هو موضح في البروتوكول بعد اختبار الخصوصية والحساسية ، تم استخدام طريقة CLas-DETECTR للكشف عن وجود CLas في الحقل.
عينات أوراق تم جمعها من شجرة البرتقال الحلو في نيوهول المزروعة في مشتل موارد الأصول الوراثية في حرم جامعة جانان نورمال ، جيانغشي ، الصين. كما تم تطبيق qPCR ، وهي طريقة مقنعة للكشف عن CLas تستخدم عادة في المختبر. تم إخضاع عينات الأوراق من شجرة نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB ، والتي تم فيها تأكيد وجود CLas في مختبرنا ، لاختبار CLas-DETECTR.
تم التقاط إشارة التألق الخضراء في العينة المصابة ب HLB ، ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والسيطرة السلبية. حددنا خصوصية CLas-DETECTR باستخدام الأحماض النووية المستخرجة من البكتيريا الأخرى. في مقايسة CLas-DETECTR ، أظهر gDNA فقط المستخرج من أوراق نيوهول الإيجابية CLas إشارات فلورية خضراء.
gDNA المستخرج من Agrobacterium tumefaciens GV3101 و Xanthomonas citri subsp. citri و Burkholderia stabilis strain 1440 لم يفعل ذلك ، مما يعني أن CLas-DETECTR يمكنه اكتشاف CLas على وجه التحديد. اختبرنا أيضا حساسية CLas-DETECTR باستخدام سلسلة من تخفيفات الحمض النووي CLas ، المدرجة في البروتوكول.
يمكن ل PCR اكتشاف 201 نسخة لكل ميغالتر. من ناحية أخرى ، يمكن ل CLas-DETECTR اكتشاف 2.01 نسخة لكل ميغالتر ، مما يشير إلى توفره كتشخيص مجال حساس. يمكن ل qPCR اكتشاف 0.201 نسخة لكل ميغالتر وقيمة Ct أعلى من 36.
لذا فإن CLas-DETECTR هو أمران من حيث الحجم أكثر حساسية من PCR التقليدي وترتيب واحد من حجم أقل حساسية من qPCR عند استخدام مضخمات CLas المحددة المخففة. أخيرا ، إعادة فحص جدوى كاشف CLas-DETECTR للعينات الميدانية ، ومقارنة حساسيته مع qPCR. في الأرقام ، نرى.
يمكننا ملاحظة أن قيمة Ct أعلى من 36 عندما يكون تركيز CLas أقل من 0.2 نسخة لكل ميغالتر، وهو تركيز منخفض جدا. من بين العينات ال 15 ، كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينات 1 و 2 و 3 و 4 و 8 و 10 و 13 و 14 المكتشفة بواسطة qPCR أقل من 36. لوحظت إشارات مضان خضراء واضحة.
من ناحية أخرى ، عندما لم يتم تحديد قيمة Ct للعينات 6 و 7 و 9 و 12 و 15 التي تم اكتشافها بواسطة qPCR ، لم تلاحظ أي إشارات فلورية خضراء. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت إشارات فلورية خضراء ضعيفة عندما كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب للعينة 5 و 11 المكتشفة بواسطة qPCR أعلى من 36. ستشير النتائج إلى أن منصتنا هي أداة سريعة وقوية وحساسة لتشخيص HLB في هذا المجال.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تتناول هذه الدراسة الحاجة إلى اكتشاف سريع ودقيق لـ Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)، العامل المسبب لمرض Huanglongbing (HLB) في نباتات الحمضيات. تجمع طريقة جديدة، تسمى CLas-DETECTR، بين تضخيم البوليميراز التبادلي وتكنولوجيا CRISPR-Cas12a، مما يسمح بإجراء اختبارات محمولة وحساسة في الميدان.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- علم أمراض النبات
- التشخيص في الزراعة
- الوراثة الميكروبية
الخلفية
- يؤثر Huanglongbing (HLB) بشدة على إنتاج الحمضيات على مستوى العالم.
- إن الكشف المبكر عن CLas أمر بالغ الأهمية لمنع انتشار المرض.
- الطرق الحالية مثل PCR لها قيود، مما يتطلب تحسينًا لقابليتها للاستخدام في الميدان.
الطرق المستخدمة
- تضخيم البوليميراز التبادلي مقترنًا بـ CRISPR-Cas12a
- تم استخدام عينات ميدانية من أوراق الحمضيات للاختبار.
- تكنولوجيا الكشف الفلوري لتصور النتائج.
النتائج الرئيسية
- أظهر CLas-DETECTR حساسية أعلى بكثير من PCR القياسي.
- تم ملاحظة فلورة محددة فقط في العينات الموجبة لـ CLas.
- يمكن أن تنتج الطريقة النتائج في غضون 90 دقيقة تحت ظروف متساوية الحرارة.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة أن CLas-DETECTR هو أداة تشخيصية قوية وحساسة لـ HLB.
- يمكن لهذه الطريقة تسهيل التدخلات في الوقت المناسب لإدارة أمراض الحمضيات بشكل فعال.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid, field-deployable detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) addresses a critical bottleneck in agricultural pathogen surveillance, enabling earlier intervention and containment of Huanglongbing (HLB) outbreaks. The integration of recombinase polymerase amplification with CRISPR-Cas12a delivers high sensitivity and specificity, supporting confident decision-making at the point of need. This diagnostic advancement enhances predictive confidence and operational agility for disease management pipelines in agri-biotech portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in plant systems.
- Supports functional validation of detection targets through CRISPR-based specificity.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing CLas from other citrus pathogens.
- Improves predictive confidence for early-stage intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant DNA extracts for downstream diagnostic workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence readouts.
- Enables scalable, field-ready screening without laboratory PCR infrastructure.
- Supports reliable evaluation of sample status for rapid triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns diagnostic outputs with disease-relevant field conditions for translational continuity.
- Bridges laboratory assay performance with real-world sample variability.
- Reduces risk in advancing detection platforms toward broader agricultural deployment.
- Provides mechanistic de-risking by confirming target specificity in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through field validation, supporting workflows from hypothesis testing to actionable diagnostics in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms pathogen presence and specificity using CRISPR-Cas12a-mediated detection.
- Screening: Offers rapid, reproducible, and quantitative fluorescence outputs for sample triage.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and comparative performance data versus PCR and qPCR.
- Translational Research: Demonstrates continuity from laboratory validation to field deployment in citrus samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, reusable diagnostic platform adaptable to other plant pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Enables standardized, rapid, and field-deployable diagnostics without complex instrumentation.
- Strategic Value: Supports timely go/no-go decisions for disease management and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and isothermal amplification techniques.
- Needs access to handheld fluorescence detection devices for field visualization.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and assay execution.
- Adaptable to various plant matrices with protocol optimization.
- Limited by the need for CRISPR-Cas12a reagents and fluorescence-compatible infrastructure.
