تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)

على الرغم من العديد من الأمثلة على التنسيق ، فإن معظم الدراسات تفحص بروتينات الأكتين أو الأنابيب الدقيقة بشكل فردي. تسمح هذه الطريقة بتصور كل من البوليمرات الديناميكية في تفاعل واحد. تسمح هذه التقنية للمستخدم بتقييم البروتينات التنظيمية المتنوعة للخصائص الناشئة التي لا يمكن رؤيتها إلا من خلال الإصدارات الديناميكية من الأكتين والأنابيب الدقيقة.

يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل الدهون أو المستخلصات للاقتراب من بناء خلية اصطناعية. ابدأ بإذابة أليكوتس مساحيق PEG-Silane و Biotin-PEG-Silane ، وإذابة مساحيق PEG في 80٪ من الإيثانول لتوليد حلول مخزون الطلاء من 10 ملليغرام لكل ملليلتر mPEG-Silane واثنين إلى أربعة ملليغرام لكل ملليلتر Biotin-PEG-Silane. قم بإزالة الغطاء النظيف من تخزين الإيثانول باستخدام الملقط.

يجف بغاز النيتروجين ويخزن في طبق بتري نظيف. قم بتغطية الغطاء ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء واحتضنها عند 70 درجة مئوية لمدة 18 ساعة على الأقل أو حتى الاستخدام. اقطع 12 شريطا من الشريط المزدوج المدعوم على الوجهين بطول 24 ملم.

قم بإزالة جانب واحد من دعامة الشريط وقم بإصلاح قطع الشريط المجاورة للأخاديد الستة الموجودة على غرفة تصوير نظيفة. قم بإزالة القطعة الثانية من الشريط الخلفي لفضح الجانب اللزج من الشريط على طول كل أخدود حجرة ، وضع جانب شريط الغرفة على سطح نظيف. امزج راتنجات الإيبوكسي وحلول التقوية واحدا تلو الآخر في قارب وزن صغير ، واستخدم طرف P1000 لوضع قطرة من الإيبوكسي المختلط بين شرائط الشريط في نهاية كل أخدود غرفة تصوير.

ثم ، ضع الغرفة أو الشريط أو جانب الإيبوكسي لأعلى ، على سطح نظيف. قم بإزالة زلة الغطاء المطلي من الحاضنة 70 درجة مئوية وشطف الأسطح المطلية وغير المطلية من انزلاقات الغطاء بالماء المقطر المزدوج ست مرات. يجف بغاز النيتروجين المصفى ثم يلصق على غرفة التصوير مع جانب طلاء الغطاء باتجاه الشريط.

استخدم طرف ماصة P200 أو P1000 للضغط على الواجهة الزجاجية المسجلة لضمان وجود ختم جيد بين الشريط وانزلاق الغطاء. احتضن الغرف المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق على الأقل للسماح للإيبوكسي بإغلاق آبار الغرفة بالكامل قبل الاستخدام. تنتهي صلاحية غرف التروية في غضون 12 إلى 18 ساعة من التجميع.

استخدم مضخة التروية وتبادل حلول التكييف بالتتابع في غرفة التروية عن طريق تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لتشغيل غرفة التصوير. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من خزان تركيب قفل الإغراء. ثم ، تدفق 50 ميكرولتر من 0.005 ملليغرام لكل ملليلتر ستربتافيدين وحضانة لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان. تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لمنع الارتباط غير المحدد واحتضانه لمدة 10 إلى 30 ثانية. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان.

بعد ذلك ، قم بتدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 1x TIRF ثم 50 ميكرولتر من بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة و 50٪ البيوتينيل المخففة في مخزن مؤقت 1x TIRF. اضبط جهاز السخان المسرحي أو الموضوعي للحفاظ على درجة حرارة 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تصوير أول تفاعل كيميائي حيوي. ثم اضبط الفاصل الزمني للاكتساب على كل خمس ثوان لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، اضبط 488 و 647 تعرضا بالليزر على 50 إلى 100 مللي ثانية عند 5٪ إلى 10٪ من الطاقة عن طريق ضبط تفاعل البلمرة أولا لبدء تجميع خيوط الأكتين. احصل على الصور بسرعة 647 نانومتر وقم بإجراء التعديلات المناسبة. ثم ، اضبط تفاعل البلمرة في تروية مشروطة ثانية جيدا لبدء تجميع الأنابيب الدقيقة.

تصور عند 488 نانومتر وإجراء التعديلات المناسبة. اجمع ثلاثة ميكرولترات من 10 ميكرومولار 488 توبولين مع 7.2 ميكرولتر أليكوت من 100 توبولين فلورسنت غير مسمى بما لا يزيد عن 15 دقيقة قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بدمج ثلاثة ميكرولترات من الأكتين المرتبط بالبيوتين المخفف في كميات مناسبة من الأكتين غير المسمى والموسوم بالفلورسنت بحيث يكون المزيج النهائي 12.5 ميكرومولار إجمالي الأكتين مع 10٪ إلى 30٪ من التسمية الفلورية.

تحضير مزيج الهيكل الخلوي عن طريق الجمع بين اثنين من الميكرولترات من 12.5 ميكرومولار الأكتين مزيج مع مزيج الأسهم توبولين لا يزيد عن 15 دقيقة قبل التصوير. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام. قم بإعداد مزيج تفاعل البروتين من خلال الجمع بين جميع المكونات والبروتينات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك المخزن المؤقت 2x TIRF ، ومضاد التبييض ، والنيوكليوتيدات ، والمخازن المؤقتة ، والبروتينات الملحقة.

احتضان مزيج الهيكل الخلوي ومزيج تفاعل البروتين بشكل منفصل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 ثانية. لبدء التفاعل ، أضف محتويات مزيج تفاعل البروتين إلى مزيج الهيكل الخلوي واخلطه. تدفق 50 ميكرولتر من مزيج التفاعل الذي يحتوي على 1x TIRF المخزن المؤقت مع استكمال 15 توبولين حرة ميكرومولار ، واحد مليمولار GTP ، 0.5 ميكرومولار أكتين مونومرات ، وأحجام مناسبة من ضوابط العازلة إلى غرفة التروية.

سجل فيلما بفاصل زمني باستخدام برنامج المجهر للحصول عليه كل خمس ثوان لمدة 15 إلى 20 دقيقة. قم بتهيئة بئر تروية جديد واستبدل حجم المخزن المؤقت بالبروتين التنظيمي ذي الأهمية وعناصر التحكم في المخزن المؤقت. الحصول على تقييم البروتينات التنظيمية لوظائف الأكتين microtubule الناشئة.

يتم عرض أمثلة على قياسات الأنابيب الدقيقة وديناميات خيوط الأكتين في هذه الصور. يتصور متوسط الإسقاط الزمني لقناة توبولين بكفاءة إجمالي أطوال الأنابيب الدقيقة لمسح الخط المستخدم لإنشاء مخططات Kymograph. تتوافق الخطوط السوداء المنقطة مع مثالين Kymographs للأنابيب الدقيقة الديناميكية.

تظهر مراحل النمو والتفكيك للأنابيب الدقيقة على كل Kymograph. يتم عرض مثالين على مونتاج صور الفاصل الزمني الذي يصور خيوط الأكتين المفردة التي تتبلمر بنشاط هنا. يتم حساب معدلات الاستطالة على أنها ميل قطع الأراضي لطول خيوط الأكتين بمرور الوقت لكل أكتين ميكرومولار.

وبالتالي ، يجب تطبيق عامل تصحيح من اثنين على تفاعلات الأكتين ميكرومولار 0.5 لمقارنة المعدلات التي تحدد عادة عند تركيز الأكتين ميكرومولار واحد. يتم عرض أمثلة من خمسة خيوط هنا. يظهر هنا إجمالي تألق الانعكاس الداخلي ، أو صور TIRF للأنابيب الدقيقة الديناميكية في خيوط الأكتين التي تتبلمر في غياب أو وجود 250 نانومولار تاو.

الخطوط الزرقاء المنقطة وعلامات الأسهم ارتداء خط تم رسمه لمخططات مسح الخط المقابلة لكل شرط. يمكن تسجيل التداخل بين الأنابيب الدقيقة في مناطق الأكتين في نقطة زمنية محددة لكل منطقة. البروتينات الخلوية الهيكلية ، وتحديدا الأكتين ، والأنابيب الدقيقة ، ومنظميها حساسة للغاية لدورات التجميد / الذوبان.

من أجل الاتساق والنجاح ، استخدم بروتينات عالية النقاء ومخزنة بشكل صحيح.