نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم

يوفر هذا البروتوكول نموذج العلاج المناعي للأورام الصلبة السريرية ومنصة بحثية لدراسة العلاقة بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية المتسللة. لقاح الورم القائم على الخلايا هذا مناسب ومباشر للاستخدام ، ويمكن دمجه مع طرق علاجية أخرى مثل حصار نقاط التفتيش ، لتحقيق تأثير إضافي أو تآزري يمكن أن يؤدي إلى مناعة أكثر قوة وعالية من الورم. ستساعد في إظهار الإجراء آن بالانسيو ، وهي فنية أبحاث من مختبري.

للبدء ، استزرع خلايا سرطان الجلد B16-F10 في IMDM ، تحتوي على 10٪ حرارة غير نشطة FBS ، 2 مليمولار جلوتامين ، 1 مليمولار بيروفات الصوديوم ، 1 مليمولار MEM أحماض أمينية غير أساسية و 100 وحدة لكل ملليلتر لكل من البنسلين والستربتومايسين. الحفاظ على خط الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بذر وحصاد خلايا B16-F10 كما هو موضح في مخطوطة النص.

قم بإزالة وسط الاستزراع واغسل القوارير مرة واحدة باستخدام PBS. قم بشفط PBS وأضف 5 ملليلتر من 0.25٪ من التربسين-EDTA ، متبوعا بالنقر بقسوة على حافة قارورة الثقافة. أضف 15 ملليلترا من وسط الاستزراع لتحييد التربسين-EDTA وصب محتويات القارورة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.

اغسل سطح الطبق ب 10 ملليلتر من PBS واسكبه في نفس أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 200 RCF. تخلص من المادة الطافية وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر بالإصبع على قاع الأنبوب.

أضف 10 ملليلتر باردة من PBS وماصة برفق تعليق الخلية. ثم عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن.

زرع داخل الأدمة 500،000 خلية B16-F10 الخلايا السرطانية في 50 ميكرولتر من PBS الباردة في الجانب الأيسر ، وذلك باستخدام إبرة قياس 30. قد تحتاج جرعة الخلايا السرطانية المزروعة B16-F10 إلى تعديلها في نطاق من 50،000 إلى 500،000 خلية لتطوير الورم بنجاح. بعد التنفيذ ، قم بقياس طول الورم وعرضه ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي الإلكتروني.

احسب حجم الورم وعالج الفئران بلقاح الورم عندما تصل الأورام إلى حجم مليمترين كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام جهاز تشعيع بالأشعة السينية عند 160 كيلوفولت و 25 مللي أمبير ، قم بتشعيع الخلايا عند 150 جرعة رمادية من أشعة جاما. عد وتحقق من صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق قبل الحقن.

حقن الفئران داخل الأدمة بمليون خلية B16-Flt3L مشعة في 50 ميكرولتر من PBS البارد على نفس الجناح مثل زرع الورم الأصلي. ما يقرب من سنتيمتر واحد من موقع الورم الرئيسي في الأيام 3 و 6 و 9 بعد زرع الخلية الأولي. ضع علامة على مواقع حقن اللقاح بقلم ملون لتمييزها عن الورم الرئيسي.

إذا تم زرع 50،000 خلية B16-F10 في البداية ، فمن المستحسن إجراء علاج اللقاح في الأيام 8 و 11 و 14. إزالة الورم جراحيا مع الجلد من كل فأر القتل الرحيم ووضعه في لوحة بئر 24 مع 1 ملليلتر من 10 ٪ FBS RPMI 1640 المتوسطة. قطع الأورام إلى قطع صغيرة في ملليلتر من عازلة الهضم واحتضانها لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

أضف 10 ملليلتر من 10٪ FBS RPMI 1640 متوسطة لوقف عملية الهضم. انقل الخلايا إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر باستخدام ماصة مصلية سعة 25 ملليلتر. ثم استخدم مكبس حقنة ملليلتر واحد لطحن الأنسجة.

أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر من وسط محدد التدرج بكثافة 40٪ في PBS المخفف إلى تركيز 1x. أضف معلق الخلية ببطء فوق 5 ملليلتر من وسط محدد متدرج الكثافة بنسبة 80٪ يحتوي على PBS.

جهاز طرد مركزي للخلايا عند 325 RCF مع إعداد فرامل منخفض لمدة 23 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اجمع بعناية طبقة الكريات البيض عند الواجهة بين 40٪ و 80٪ من الوسط المحدد للتدرج الكثافة، وقم بتمريرها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 500 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

احتضان الحبيبات في ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف 10 ملليلتر من وسيط FBS RPMI 1640 بنسبة 10٪ لإخماد المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 400 RCF لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

أعد تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من وسط FBS RPMI 1640 بنسبة 10٪ ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا قبل الاستخدام لمزيد من التحليل. اجمع الطحال أو الغدد الليمفاوية المستنزفة كعناصر تحكم لاستراتيجية بوابة المجموعات الفرعية للخلايا المناعية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. اتبع طريقة عزل الخلية الموضحة في مخطوطة النص.

عادة ما لوحظت نقطة سوداء مرئية لخلايا B16-F10 المزروعة على سطح الجلد بعد حوالي ثلاثة أيام من زرع الورم. وعولجت الفئران بلقاح الورم بعد ثلاثة وستة وتسعة أيام من وصول العقيدة الورمية إلى حجم مليمترين أو تجاوزه. لوحظ انخفاض كبير في نمو الورم في مجموعة الفئران الملقحة بعد حوالي أسبوعين من زرع الورم.

احتوت الخلايا التي تم جمعها من طبقة الكريات البيض على العديد من الخلايا السرطانية ، مما يجعل من الصعب تحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية بسهولة. لذلك ، تم استخدام الخلايا الطحالية بالتوازي ، من أجل البوابات المناسبة للمجموعات الفرعية للخلايا المناعية داخل الورم في تحليل قياس التدفق الخلوي. تم رسم استراتيجيات بوابات CD103 الإيجابية ، CD11C إيجابية DC ، CD8 إيجابية ، CD4 إيجابية ، و Treg جنبا إلى جنب مع مصفوفة التعويض.

كما تم توفير بيانات تمثيلية للحسابات المكتسبة وتواتر كل مجموعة سكانية. أظهر CD103 الإيجابي داخل الورم ، CD11C الإيجابي DC من الفئران الملقحة ، تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ عن الرباط التحفيزي المشترك CD86. أظهرت الفئران الملقحة أيضا زيادة في تسلل الورم الإيجابي CD8 والخلايا الإيجابية CD4 ، والخلايا السلبية Foxp3 ، وكذلك في CD8 الإيجابي للجرانزيم B الإيجابي و CTLs إيجابية جاما الإنترفيرون.

حافظ على مسافة كافية بين الورم الرئيسي ولقاح الورم. هذا الفصل الجسدي أمر بالغ الأهمية لتجنب الاندماج المحتمل بين غرستي الورم.