تصور التوطين تحت الخلوي لبروتين في القلب باستخدام وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية متبوعا بالمجهر الإلكتروني النافذ
سبتمبر 16, 2022
يصف البروتوكول الحالي طريقة لوضع العلامات المناعية على البروتين في أقسام أنسجة القلب باستخدام النقاط الكمومية. توفر هذه التقنية أداة مفيدة لتصور توطين أي بروتين تحت خلوي والتعبير عنه على مستوى البنية الفائقة.
يعد تحديد التوطين دون الخلوي للبروتين أمرا بالغ الأهمية لتحديد وظيفته الصحيحة والآليات المشاركة فيه. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في تصور التوطين تحت الخلوي للبروتين على مستوى البنية الفائقة. يعتبر وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية أكثر استقرارا ، ومقاوما للتبييض الضوئي ، وله أطياف انبعاث خاصة به ، وينتج كثافة إلكترونية عالية ، ويعرض كفاءة أعلى واحتفاظا بالأنسجة مع اختراق أفضل في الأنسجة.
تعد الخطوات المتعددة للعملية ، وهي التثبيت والحفر والحجب والتركيز الأمثل للنقاط الكمومية ، خطوات صعبة للتحسين. ينصح بتجربة نقاط زمنية متعددة وتركيزات الكواشف المستخدمة. التحدي الآخر هو التعامل مع الشبكات التي لا يعمل فيها سوى الصبر ، وبالطبع الممارسة.
سيوضح الإجراء شودري عبد الله ، زميل البريد ، ونازنين ريمكس ، طالبة دراسات عليا من مختبري ، وبراندون هارتمان ، مشرف المجهر الإلكتروني من خدمات الفحص المجهري الإلكتروني لدينا. بعد تخدير الفئران وفتح تجويف الصدر ، غزير القلب باستخدام الثلج البارد 3٪ الجلوتارالدهيد في 0.1 مولار من محلول كاكوديلات الصوديوم لمدة دقيقتين. استخدم إبرة قياس 25 من خمسة في ثمانية بوصات لإدخال المثبتات في القلب باستخدام ضغط الجاذبية.
مباشرة بعد أن يبدأ القلب في الامتلاء بالمثبت ، ارفع قمة القلب لتخفيف الضغط. اقطع الأوعية الموجودة تحتها على بعد ملليمتر واحد إلى ملليمترين من القلب واترك السوائل تستنزف. تشريح القلب.
أزل الأذينين وأسقط البطينين في طبق بتري يحتوي على ثلج بارد 3٪ جلوتارالدهيد و 0.1 مولار كاكوديلات الصوديوم. اصنع فراشة مقطوعة بعد 30 إلى 60 دقيقة من التثبيت وضع البطين مرة أخرى في طبق بتري. يقطع القلب باستخدام شفرة جراحية في مكعبات صغيرة من ملليمتر مكعب واحد.
إصلاح وغمر أنسجة القلب تشريح في محلول الجلوتارالدهيد و cacodylate لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد 24 ساعة من التثبيت ، اغسل المنديل في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 المولي مرتين لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة الأنسجة من محلول كاكوديلات الصوديوم واغمرها في محلول رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
بعد التناضح ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات الصوديوم بنسبة 2٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات اليورانيل 2٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ أسيتات اليورانيل ، قم بتجفيف الأنسجة بالتتابع من خلال الكحوليات المتدرجة والأسيتون.
قم بتضمين الأنسجة المجففة في راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة كما هو موضح في المخطوطة. ضع الأنسجة في راتنج طازج في قوالب دقيقة بحجم ثمانية ملليمترات وعالج الأنسجة المدمجة عند 70 درجة مئوية طوال الليل. بعد العثور على منطقة الاهتمام ، باستخدام سكين فائق 45 درجة ، قم بإنتاج أقسام ذهبية شاحبة فائقة النحافة.
ضع هذه الأقسام فائقة النحافة على الجانب الباهت من شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة. ابدأ التلوين عن طريق كشف المستضد عن طريق وضع 20 ميكرولتر من محلول النقش على فيلم بارافين نظيف. ضع الشبكة المجففة مع أقسام الأنسجة على قطرة محلول الحفر.
اترك شبكة المقطع على المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أقسام الأنسجة المحفورة بوضعها على قطرة من الماء المقطر لمدة 60 ثانية. اسد الألدهيدات المتبقية عن طريق وضع شبكة المقطع على قطرة من محلول جليكاين 0.05 مولار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح لإزالة محلول الجلايسين المتبقي. ضع شبكة المقطع في 10 إلى 20 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح وضع أقسام الشبكة على مخفف الأجسام المضادة للتكييف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
احتضان أقسام الشبكة بالجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة و 30 دقيقة في غرفة مرطبة. جفف الشبكة واغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. احتضان أقسام الشبكة مع الأجسام المضادة الثانوية biotinylated لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة.
بمجرد تجفيف الشبكة ، اغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. احتضان أقسام الشبكة في QD المقترن بالستربتافيدين المتاح تجاريا لمدة ساعة واحدة في غرفة في درجة حرارة الغرفة. منع التعرض للضوء من خلال تغطية الغرفة بورق الألمنيوم.
بعد تجفيف حواف الشبكة باستخدام ورق الترشيح ، اغسل أقسام الشبكة بوضعها على قطرات الماء لمدة دقيقتين وامسح حواف الشبكة حتى تجف. أدخل حامل العينة في عمود المجهر وقم بتشغيل مفتاح المضخة لتقييم مقياس الزوايا ، متبوعا بالإدخال الكامل لحامل العينة في عمود المجهر. ركز جيدا على المنطقة المطلوبة.
التقط الصورة باستخدام كاميرا رقمية عالية السرعة واحفظ الملف بتنسيق tif. أظهرت أغشية الميتوكوندريا ، والليزوزومات ، والشبكة الإندوبلازمية أو واجهة الميتوكوندريا الغشائية الشبكية الساركوبلازمية وجود نقاط كمومية تحمل علامة Sigmar1. تم تصور أقسام القلب باستخدام الغلوبولين المناعي للأرانب G والنقاط الكمومية كعنصر تحكم في النمط المتماثل للجسم المضاد الأساسي للأرانب Sigmar1.
أحد الأشياء المهمة التي يجب مراعاتها أثناء العمل على هذا البروتوكول هو الكشف عن وقت المستضد. إذا كانت أقسام الأنسجة محفورة لفترة طويلة جدا ، فإن الحل metaperiodate سيخلق ثقوبا في أقسام الأنسجة الرقيقة. يكتسب وضع العلامات بوساطة النقاط الكمومية اهتماما في اكتشاف الورم ، والتنميط الجزيئي للورم والحالة المناعية ، وتصوير الأنسجة مما يمهد طريقة جديدة للتشخيص الطبي.
النقاط الكمومية مفيدة أيضا في علاج الأورام عن طريق العلاجات الضوئية الديناميكية وتشوهات العيون عن طريق توصيل الدواء إلى العينين.
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة بروتوكولًا لوضع العلامات المناعية للبروتينات في أقسام أنسجة القلب باستخدام النقاط الكمومية، مما يمكّن من تصور توطين البروتين وتعبيره على المستوى الفوقي البنائي. تعتبر الطريقة حاسمة لفهم وظيفة البروتين والآليات المرتبطة به.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- توطين البروتين
- تصوير أنسجة القلب
- النقاط الكمومية في الفحص المجهري
الخلفية
- تحديد توطين البروتين ضروري لفهم الوظائف البيولوجية.
- توفر النقاط الكمومية فوائد مثل الاستقرار والمقاومة للتلاشي الضوئي.
- يعتبر تحسين طرق التثبيت والتضمين تحديًا لكنه حاسم للحصول على تصوير فعال.
الطرق المستخدمة
- وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية
- أنسجة القلب من الفئران
- الفحص المجهري الإلكتروني وتقنيات التلطيخ المختلفة
النتائج الرئيسية
- تم إثبات وضع العلامات المناعية الناجح لـ Sigmar1 في أقسام أنسجة القلب.
- كشف التصوير عالي الدقة عن وجود النقاط الكمومية في أغشية الميتوكوندريا والهياكل الخلوية الأخرى.
- تم تحديد الظروف المثلى لكشف المستضد لتجنب تلف الأنسجة.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول تصور توطين البروتين في الأنسجة القلبية باستخدام النقاط الكمومية.
- تساهم النتائج في التقدم في التشخيص الطبي والبحث العلاجي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Precise subcellular localization of proteins in cardiac tissue is essential for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines. Quantum dots-mediated immunolabeling combined with transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution visualization, supporting predictive confidence in protein function assignments. This capability strengthens translational continuity and informs risk-adjusted portfolio decisions for cardiovascular and broader organ system research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein distribution at the ultrastructural level for functional hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying protein localization within organelles and membrane interfaces.
- Improves predictive confidence in target selection by providing spatial context for protein activity.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for downstream quantitative imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility through stable, photobleaching-resistant quantum dot labeling.
- Provides high-resolution, quantitative outputs for comparative analysis of protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular localization data with disease-relevant cardiac models for translational biomarker development.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation by mapping protein presence in situ.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming target engagement at the organelle level.
Pipeline & Workflow Integration
This quantum dot-TEM workflow integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, providing a reusable platform for protein localization studies across organ systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein distribution in cardiac tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables high-resolution measurement of protein localization for condition comparison.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by confirming subcellular protein presence.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Provides stable, reproducible, and scalable imaging for cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and immunolabeling techniques.
- Demands access to TEM instrumentation and quantum dot reagents.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols.
- Adaptable to various tissue types and organ systems with protocol optimization.
- Optimization of antigen unmasking and reagent concentrations is critical to avoid tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Animal Preparation
2:39
Heart Tissue Processing and Embedding
3:47
Tissue Sectioning Using an Ultramicrotome and Ultrathin Heart Section Staining
6:19
Transmission Electron Microscopy Imaging
6:48
Results: Visualization of Sigmar1 Using Quantum Dots
7:22
Conclusion
