إعادة تشكيل تجميع السبعين في الأغشية لدراسة الخصائص والوظائف الفيزيائية الحيوية

سيوجه هذا البروتوكول أولئك الذين يعملون على بروتينات ربط الغشاء لتحديد كيف يلعب شكل الغشاء دورا في تنظيم تجمعات البروتين. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي تنوعها لنوع البروتين وتكوين الغشاء وهندسة الغشاء. كما يسمح باستجواب كيف يمكن للطبقة الثنائية الدهنية تغيير خصائص البروتينات المرتبطة بها.

لتحديد غشاء جيد للتجربة، نقترح إنشاء قائمة مرجعية قد تشمل معدلات انتشار الدهون، وحركة البروتين محل الاهتمام، وما إذا كانت هناك جسيمات دهنية غير منفجرة أو جسيمات دهنية منصهرة عالقة على السطح. لبدء تنظيف البلازما للشرائح ، قم بتطهير منظف البلازما لمدة خمس دقائق بالأكسجين لإزالة الهواء من الخطوط والحجرة. رتب انزلاقات زجاجية جافة في مهد من السيراميك.

أثناء التطهير ، قم ببث غاز خامل فوق شرائح زجاج الغطاء الصغير لإزالة الغبار والجسيمات. ضع المهد في الجزء الخلفي من غرفة البلازما بحيث تكون أغطية الأغطية موازية للحافة الطويلة للغرفة. قم بتشغيل منظف البلازما لمدة 15 دقيقة بالأكسجين بأقصى طاقة.

لإعداد الغرفة ، اقطع الغطاء أسفل الجزء المتجمد مباشرة من أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر. قم بطلاء حافة أنبوب PCR باستخدام مادة لاصقة منشطة بالأشعة فوق البنفسجية مع تجنب الجزء الداخلي من الأنبوب. ضع بلطف غراء أنبوب PCR لأسفل في وسط غطاء البلازما النظيف ، ثم ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي لمدة خمس إلى سبع دقائق لعلاج المادة اللاصقة.

لتشكيل طبقة ثنائية ، أضف الكواشف إلى البئر. هز الغرف بلطف من جانب إلى آخر لتعطيل سيارات الدفع الرباعي ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، اشطف الطبقة الثنائية ست مرات ب 150 ميكرولتر من SLBB عن طريق السحب لغسل الدهون الزائدة ، ثم اغسل الطبقة الثنائية ست مرات ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل قبل الحضانة مع السبتين.

في خطوة الغسيل الأخيرة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للتفاعل ، تاركا 75 ميكرولتر في البئر. أضف 25 ميكرولتر من السيبتين المخفف في SSB والصورة بواسطة المجهر TIRF. أولا ، دوامة الزجاجة التي تحتوي على ميكروسفير السيليكا لمدة 15 ثانية ، ثم سونيكات الحمام لمدة دقيقة واحدة والدوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية لكسر أي مجموعات.

امزج الخرز مع SLBB و 10 ميكرولترات من خمس سيارات دفع رباعي ملليمولار في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق. احتضن خليط الدهون من الخرز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمنع الترسيب. في غضون ذلك ، قم بإذابة غطاء pegylated وقم بلصق أنبوب PCR مقطوع 0.2 ملليلتر به.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخرز لمدة 30 ثانية في RCF المعين. بعد الدوران الأول ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من supernatant ، ثم أضف 200 ميكرولتر من PRB واخلطها عن طريق السحب القوي. بالنسبة للجولات التالية ، قم بإزالة 200 ميكرولتر من PRB وإضافة 200 ميكرولتر آخر بعد الدوران الثاني والثالث وإضافة 220 ميكرولتر من PRB بعد الدوران الرابع.

إذا قمت بإجراء فحص منافسة بأحجام حبة متعددة ، فقم بإعداد التفاعل عن طريق خلط كميات متساوية من كل حجم حبة وتخفيف 29 ميكرولتر من خليط الخرز هذا مع 721 ميكرولتر من مخزن التفاعل المؤقت ، ثم أضف 75 ميكرولتر من الخرز المخفف و 25 ميكرولتر من البروتين المخفف في SSB إلى الآبار واخلطها. إذا كان قياس السيبتين في حالة ثابتة ، فقم باحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ثم قم بتصويره إما بالقرب من TIRF أو المجهر البؤري. أظهرت الصور المجهرية TIRF ل SLBs المستوية المحتضنة مع السيبتين الموضحة باللون الأخضر توزيعا متجانسا للبروتين.

أظهرت SLBs المصنوعة من أغطية زجاجية سيئة التنظيف ثقوبا أو فجوات في الطبقة الثنائية في مناطق منخفضة السبعين. قد تتراكم الجسيمات الشحمية غير المنفجرة والأنبوبية على السطح إذا تم استخدام الجسيمات الشحمية القديمة أو إذا لم تكن الغسولات صارمة. في الصور المجهرية للميكروسفير المغلف بالدهون التي تم تصورها باستخدام رودامين PE أظهرت ترسبا سلسا ثنائي الطبقة.

كانت الدعامات الكروية مغلفة بالتساوي بواسطة الغشاء وكان هناك عدد قليل من مجموعات الخرز. تسبب الغسيل غير الكافي للدهون الزائدة في طلاء غشاء غير متساو كما لوحظ من خلال كتل الدهون وتسبب التعامل غير السليم مع فجوات في الطبقة الثنائية. تسبب الخلط غير الكافي للخرز في التكتل وهو أمر غير مثالي لقياس امتصاص البروتين الكلي.

باستخدام الطبقات الثنائية للدهون المدعومة المعروضة هنا ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلوري ، وقياس الخلايا الجماعية للأغشية ، ومجهر القوة الذرية عالي السرعة لفحص ديناميكيات البروتين والبروتين أو غشاء البروتين المختلفة.