تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

تسمح تقنية التقشير بفصل عينات cryo-EM البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة التركيز وتسهيل معالجة الصور. يمكن زيادة تركيزات العينات قبل تحضير الشبكة ، ويمكن تعديل لطخة التقشير لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينات أحادية الطبقة لجمع البيانات بكفاءة عالية. للبدء ، قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر ووضع فيلم بارافين طويل بجواره بحيث يكون الورق متجها لأعلى.

ضع قطعة من ورق الترشيح دون الميكرون فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح. ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل وحدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس أو اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو أي سطح مرتفع آخر لتجنب ملامسة الشبكة النظيفة مع العناصر الأخرى.

قم بإزالة الورق من فيلم البارافين واسحب الجوانب لإنشاء حافة صغيرة. ماصة اثنين 150 ميكرولتر قطرات 4٪ محلول تريهالوز في حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين من جانب قصير واحد من فيلم البارافين. يجب أن تكون المسافة بين القطبتين حوالي سنتيمتر واحد.

بعد ذلك ، على مقعد منفصل أو على الأرض ، صب النيتروجين السائل في وعاء صغير من رغوة البوليسترين وضع حاوية شبكة cryo-EM صغيرة في النيتروجين السائل. قم بتغطية وعاء رغوة البوليسترين بمناديل خالية من النسالة. لتعويم فيلم الكربون من الميكا ، استخدم Dumont 5 Forceps والمس جانبا واحدا من الميكا بزاوية طفيفة لأسفل على إحدى قطرات محلول تريهالوز.

حرك الميكا لأسفل للسماح لتوتر الماء برفع فيلم الكربون ببطء. حرر الميكا بمجرد أن يطفو فيلم الكربون على سطح القطرة. افحص بصريا فيلم الكربون لتجنب استخدام الكربون مع تلف في شكل كسور.

أدخل الشبكة التي يحملها الملقط المضاد للشعيرات الدموية بزاوية 20-30 درجة في قطرة تريهالوز في موضع مجاور ، ثم قم بتوسيط الشبكة أسفل فيلم الكربون. التقط فيلم الكربون ، وحافظ على الشبكة في نفس الاتجاه وقم بخفض الشبكة ببطء على سطح القطرة الثانية من trehalose دون كسر التوتر السطحي للقطرة. سيؤدي ذلك إلى إزالة فيلم الكربون غير الضروري الذي قد يكون ملفوفا حول حافة الشبكة إلى الجانب الخشن.

قم بتدوير الملقط المضاد للشعيرات الدموية وضعه على طبق بتري بحيث يكون الجانب الكربوني للشبكة متجها لأسفل. ماصة 1.3 ميكرولتر من العينة في الغضروف المفصلي trehalose طفيف على الجزء العلوي من الشبكة. بعد ذلك ، ماصة المحلول حوالي 8-10 مرات لخلط وتوزيع trehalose والعينة على جانبي الشبكة.

ماصة واحدة أو أكثر من قطرات 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز على فيلم البارافين أثناء احتضان عينة محلول تريهالوز على الشبكة لمدة دقيقة واحدة. قم بتدوير الشبكة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى واضغط على الشبكة على ورقة الترشيح تحت الميكرون باستخدام الملقط المضاد للشعيرات الدموية. بمجرد أن يتم امتصاص المحلول بواسطة ورق الترشيح ويكون فيلم الكربون مسطحا ، انتظر لمدة ثلاث ثوان قبل رفع الشبكة وتحريكها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز.

يمكن تكرار هذه الخطوات بين تكرار واحد إلى ثلاثة أو أكثر ، اعتمادا على العينة. امسح الشبكة على قطعتي ورق الترشيح ثم ارفع الشبكة من ورق الترشيح. بعد حوالي 13 ثانية ، اعتمادا على الرطوبة والمخزن المؤقت للعينة ، قم بغمر الشبكة في النيتروجين السائل في حاوية الستايروفوم الصغيرة وضعها في حاوية شبكة cryo-EM أو نقلها مباشرة لفحص cryo-EM أو جمع البيانات.

تظهر هنا عينة بلورية ثنائية الأبعاد من سينسيز الليكوترين C4 البشري الخاضع لطريقة قشر اللطخة. تم تقليل المنطقة الموجودة على يسار السهم إلى حد كبير إلى بلورات 2D أحادية الطبقة في منطقة تلامس بين فيلم الكربون وشريط الشبكة الذي تم تقشيره ثم إزاحته. لم تتأثر المنطقة الموجودة على يمين السهم ببقعة التقشير.

يمثل النصف السفلي من الصورة المناطق ذات الطبقات الثنائية الكبيرة ذات الطبقة الفوسفو الدهنية الكبيرة ذات الطبقة الواحدة الناتجة عن تطبيق لطخة التقشير. لم يكن النصف العلوي في منطقة تلامس بين شريط الشبكة وفيلم الكربون ، وبالتالي احتوى على جسيمات شحمية كاملة مع طبقتين فوسفوليبيد. يظهر مربع الشبكة لشبكة 400 شبكة بصمة شريط الشبكة والمناطق الناتجة عن التقشير بالإضافة إلى المناطق التي لم تكن على اتصال بشريط الشبكة أو تعرضت لعدد أقل من تكرارات بقع التقشير.

أظهرت هذه الصور نشاف شبكة EM محضرة عن طريق الحقن الخلفي على ورقة ترشيح دون ميكرون باستخدام فيلم كربوني رقيق جدا. الصور عبارة عن إطارات مفردة عند التلامس الأولي مع الغشاء ، 1،000 مللي ثانية بعد الاتصال ، و 2،000 مللي ثانية بعد الاتصال. يشير السهم إلى مربعات الشبكة حيث أدى الضغط الشعري إلى تمزق فيلم الكربون.

يعد تجنب الكسور في فيلم الكربون والجمع بين ورق الترشيح تحت الميكرون مع قطرة تريهالوز 1.7 ميكرولتر للشفط ثم فصل الطبقات من الخطوات الرئيسية. يتم استخدام العينات المقشرة لجمع بيانات cryo-EM عالية الدقة ، تليها معالجة الصور لتحديد الهيكل. تسمح لطخة التقشير بتحديد منظم لبلورات البروتين 2D أحادية الطبقة التي كانت في السابق سميكة جدا بالنسبة ل cryo-EM.

علاوة على ذلك ، يمكنه تركيز عينات مختلفة في طبقات مفردة على فيلم الكربون.