التصوير المتزامن لديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة
August 23rd, 2022
هنا ، نصف بروتوكولا يجمع بين حقن الفيروس المرتبط بالغدي وزرع نافذة الجمجمة للتصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة.
يتيح بروتوكولنا التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة. يمكن تطبيقه على نطاق واسع للتحقيق في سلوك مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة أو التفاعل مع الخلايا العصبية. ميزة هذه الطريقة هي أن القطع الأثرية المتحركة لا تلوث بيانات التصوير بسهولة بسبب التثبيت القوي للرأس.
أيضا ، تسمح لنا الاستعادة بعد التصوير بمعدل الإطارات المرتفع بإزالة قطعة أثرية متحركة من البيانات. في هذه الطريقة ، فإن حقن AAV وجراحة زرع نافذة الجمجمة تتطلب تقنيا. الفشل شائع في البداية ، لذا من فضلك لا تشعر بالإحباط وتدرب أكثر.
لتحضير جهاز الحقن ، ضع ماصة زجاجية متصلة بحقنة هاملتون قياس 26 من خلال أنبوب على حامل ماصة لأداة مجسمة. ثم قم بإمالة حامل الماصة 60 درجة أمامية من المحور الرأسي. املأ الماصة الزجاجية والمحقنة وأنبوب التوصيل بالبارافين السائل وضع المحقنة على حاقن دقيق.
إدارة تسكين للفأر المخدر وإرفاق قضبان الأذن المساعدة. ثم ، ثبت الحيوان على أداة التجسيم مع جانبها الظهري لأعلى. بعد إزالة الشعر من موقع الجراحة وتطهير المنطقة الجراحية ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين على فروة الرأس على طول خط الوسط ، مما يضمن تعرضا جيدا للجمجمة فوق القشرة البصرية الأولية اليمنى.
استخدم ملقط لإزالة السمحاق على الجمجمة المكشوفة. حفر الجمجمة على إحداثيات التجسيمية ثلاثة ملليمترات جانبية إلى خط الوسط و 5 ملليلتر الأمامي لخط لامدا لإنشاء ثقب صغير يبلغ قطره حوالي 0.5 ملم. ثم ضع قطعة من الفيلم الشفاف حوالي سنتيمترين في سنتيمترين على الجمجمة المكشوفة للماوس.
طرد ميكرولتر واحد من قطرة محلول AAV على الفيلم باستخدام ماص. تقدم المحقنة. ضع طرف ماصة زجاجي في قطرة محلول AAV على الفيلم واسحب المحقنة برفق لشفط محلول AAV.
بعد ذلك ، أدخل ماصة الزجاج على عمق 500 ميكرومتر من سطح الدماغ من خلال الفتحة التي تم إنشاؤها في الجمجمة. بعد ذلك ، قم بحقن 0.5 ميكرولتر من محلول AAV باستخدام الحاقن الدقيق بمعدل تدفق حجم حقن يبلغ 2 ميكرولتر في الساعة. اسحب الإبرة وشطف سطح الدماغ بالمحلول الملحي.
إنشاء أخدود دائري على طول العلامة على الجمجمة عن طريق الحفر. نظف الحطام لضمان رؤية الجمجمة وتطبيق محلول ملحي لمنع التسخين أثناء الحفر. اضغط برفق على الجمجمة المركزية بالملقط.
عمق الحفر كاف إذا تحرك عموديا مع مقاومة قليلة. عندما يصل الأخدود إلى عمق كاف ، أدخل طرف الملقط في الجزء السفلي من جزء الجمجمة المركزي. ارفعه برفق وقم بإزالته لكشف سطح الدماغ.
باستخدام إبرة قياس 27 ، وخز وتمزيق الجافية على حافة سطح الدماغ المكشوف. أدخل طرف الملقط من خلال الفتحة الموجودة على حافة الجافية وقشرها لكشف سطح الدماغ. بعد تشتيت ألياف مرقئ واحدة تلو الأخرى في محلول ملحي ، ضع ألياف مرقئ على طول حواف الفتحة التي يوجد فيها الجافية المعبرة.
ضع نافذة الجمجمة على سطح الدماغ المكشوف ثم ألصقها بالجمجمة بالغراء الفوري مع الضغط برفق على النافذة. بعد ذلك ، ضع الغراء الفوري على الجمجمة المكشوفة بأكملها. بعد ذلك ، قم بتوصيل لوحة رأس بعناية على الجمجمة لتحديد نافذة الجمجمة في وسط الفتحة المربعة للوحة الرأس.
بمجرد أن يصلب الغراء بشكل كاف ، ضع أسمنت الأسنان على الجمجمة المكشوفة لتعزيز الارتباط بين الرأس وشفرة الرأس. لتثبيت جهاز التظليل المخصص وشاشة LCD للتحفيز البصري ، ضع العدسة أولا للتركيز على سطح الدماغ ثم قم بتعيين موضع العدسة هذا كموضع Z الأصلي. حافظ على إحداثيات XY ثابتة وارفع العدسة الموضوعية.
قم بإزالة الماوس والأداة المجسمة من العدسة الموضوعية. قم بتوصيل جهاز تظليل أعلى لوحة الرأس باستخدام السيليكون ، مع التأكد من أن المسافة بين لوحة الرأس وجهاز التظليل محكمة الغلق. املأ جهاز التظليل بالماء المقطر.
ثم ، قم بإصلاح الماوس باستخدام الإطار التجسيمي تحت العدسة الموضوعية. أعد ضبط المستوى البؤري بعناية على سطح الدماغ ، وتحقق من عمق العدسة الموضوعية. قم بتغطية العدسة الموضوعية بورق الألمنيوم الأسود لتجنب تلوث الضوء من شاشة LCD.
اضبط شاشة LCD مقاس 10 بوصات على ارتفاع 12.5 سم أمام أعين الماوس لتقديم محفزات بصرية. قم بتكوين مرشحات مجموعة تقديم الفلورسنت ل EGFP و R-CaMP والطول الموجي للإثارة إلى 1،000 نانومتر. احصل على صور بدقة مكانية تبلغ 0.25 ميكرون لكل بكسل.
ابحث عن منطقة التصوير حيث يمكن تصوير الخلايا العصبية الإيجابية R-CaMP والخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية EGFP في وقت واحد. في الطبقة 2 ، 3. احصل على صور بمعدل إطارات 30 هرتز.
بالتزامن مع التقاط الصورة ، قدم محفزات بصرية صريف الانجراف إلى الماوس في 12 اتجاها في ستة اتجاهات ، من صفر إلى 150 درجة في خطوات 30 درجة. بعد الحصول على الصورة ، قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر. افصل جهاز التظليل وأداة التجسيم عن الماوس ، وأعد الماوس إلى قفصه الرئيسي.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم إجراء حقن AAV وزرع نافذة الجمجمة في القشرة البصرية الأولية لفأر معدل وراثيا عمره ثمانية أسابيع ، تلاه تصويران فوتونيان للنشاط العصبي القائم على R-CaMP وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الطبقة 2 ، 3. تم تقديم المحفزات البصرية الشبكية للفأر وتم تحليل الاستجابات البصرية في العمود الفقري الزدري باستخدام آثار الكالسيوم. أظهرت العمليات الدبقية الصغيرة ديناميكيات سريعة وغيرت مورفولوجيتها في غضون 10 ثوان.
باستخدام التصوير ثنائي الفوتون في الطبقة 2 ، 3 من القشرة البصرية الأولية في فأر معدل وراثيا عمره 12 أسبوعا ، لوحظ R-CaMP في الخلايا العصبية ، كما هو موضح هنا في اللون الأرجواني. لوحظ EGFP في الخلايا الدبقية الصغيرة ، شوهد باللون الأخضر. كما لوحظت إشارات فردية ل EGFP و R-CaMP.
يعد حقن AAV الناجح أمرا بالغ الأهمية لهذه الطريقة. الأسباب الرئيسية لفشل حقن AAV هي الماصات الزجاجية على مدار الساعة وتلف الأنسجة. تم تحديد سلوك المراقبة على الخلايا الدبقية الصغيرة وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة في SNAP لتكون سائدة في آليات مسببة للأمراض المختلفة ، مثل مرض الزهايمر.
طريقتنا مفيدة للبحث الذي يركز على هذا المجال.
المراجع
توضح هذه الدراسة بروتوكولًا يجمع بين حقن الفيروس المصاحب للغدة (AAV) وزرع نافذة جمجميّة لتمكين التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الشبكية والخلايا العصبية في الفئران المستيقظة. تسمح هذه الطريقة للباحثين بالتحقيق في سلوك المراقبة للخلايا الشبكية وتفاعلاتها مع الخلايا العصبية مع التقليل من أثر الحركات خلال التصوير.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التصوير العصبي
- علم الأحياء العصبية
الخلفية
- تلعب الخلايا الشبكية دورًا أساسيًا في صحة الدماغ ومرضه.
- التصوير في الوقت الحقيقي لديناميكيات الخلايا الشبكية ضروري لفهم وظائفها.
- يُستخدم AAV بشكل شائع لتوصيل المواد الوراثية في تطبيقات علم الأعصاب.
- تثبيت الرأس في الفئران المستيقظة يقلل من أثر الحركات أثناء التصوير.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لتصوير الخلايا الشبكية والتفاعل مع الخلايا العصبية.
- تعزيز فهم ديناميكيات الخلايا الشبكية والنشاط العصبي في ظل الظروف الفسيولوجية.
- التقليل من تلوث البيانات بسبب أثر الحركات أثناء التصوير.
الطرق المستخدمة
- يتضمن البروتوكول حقن AAV وزرع نافذة جمجميّة في القشرة البصرية الأساسية للفئران المستيقظة.
- يتكون النموذج البيولوجي من فئران معدلة وراثيًا تعبر عن بروتينات فلورة.
- تشمل الخطوات الرئيسية إحداثيات قياسية دقيقة للحقن وإجراءات جراحية لوضع النافذة الجمجمية.
- تم إجراء التصوير باستخدام مجهر ثنائي الفوتون بمعدل إطار 30 هرتز.
- تم تحليل مسارات الكالسيوم من الخلايا العصبية والخلايا الشبكية استجابةً للمنبهات البصرية.
النتائج الرئيسية
- لوحظت ديناميكيات سريعة في العمليات الشبكية، والتي غيرت شكلها في غضون 10 ثوانٍ.
- كشف التصوير المتزامن عن نشاط الخلايا العصبية وديناميكيات الخلايا الشبكية استجابةً للمنبهات البصرية.
- أثبت البروتوكول فعالية AAV والنوافذ الجمجمية للتصوير عالي الجودة.
الاستنتاجات
- تُمكّن هذه الطريقة من الملاحظة في الوقت الحقيقي للخلايا الشبكية والتفاعلات العصبية، مما يوفر رؤى حول ديناميكيات الدماغ.
- تسهم الدراسة بأدوات قيّمة لفهم أدوار الخلايا الشبكية في الآليات العصبية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية التحقيق في تأثيرات التدخلات المختلفة على النشاط الشبكي والعصبي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice enables direct interrogation of neuroimmune interactions at single-cell resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for neuroinflammatory and neurodegenerative disease models. Integrating real-time glial-neuronal readouts advances portfolio decisions by clarifying pathway engagement and functional outcomes in translationally relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-neuron interactions under physiological and stimulated conditions.
- Supports functional target validation by linking immune cell dynamics to neuronal activity in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory and synaptic plasticity hypotheses.
- Improves predictive confidence for CNS target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for quantitative assessment of neuronal and microglial responses.
- Provides reproducible, motion-artifact-minimized datasets for downstream analysis and screening.
- Enables standardization of visual stimulus protocols and imaging parameters for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on neuroimmune interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuroimmune mechanisms observed in human CNS disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and synaptic modulation programs.
- Provides translational biomarker candidates based on real-time cellular activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of neuroimmune interactions in awake, behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial surveillance and neuron-glia signaling in response to peripheral and central stimuli.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-resolution calcium traces and morphological data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to diverse CNS targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and minimizes motion artifacts for reproducible data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroimmune programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional in vivo evidence.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in stereotaxic surgery, AAV delivery, and cranial window implantation.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to various brain regions and transgenic models with protocol optimization.
- Initial technical failure rates may be high; proficiency improves with practice and experience.
