التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في Caenorhabditis elegans

التعلم والذاكرة أمران حيويان للحيوانات للبقاء على قيد الحياة والتكاثر من خلال التنقل بكفاءة في البيئات المتغيرة باستمرار. كما أنها واحدة من الموضوعات الرئيسية التي تمت دراستها في علم الأعصاب. Caenorhabditis elegans هو كائن جذاب لدراسة التعلم والذاكرة بسبب بساطة نظامه العصبي.

كما تم إعادة بناء مخططات الأسلاك الكيميائية والكهربائية بالكامل. التحليل السلوكي ل Caenorhabditis elegans صعب للغاية ويتأثر بعدد من المعلمات مثل الضغوط الكيميائية والميكانيكية ودرجة الحرارة. للبدء ، قم بإعداد وسط نمو الديدان الخيطية بطول ستة سنتيمترات ، أو ألواح NGM ، عن طريق نشر 0.2 ملليلتر من ثقافة سائل E.coli OP50 في وسط Luria-Bertani واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.

في اليوم الأول ، اختر وضع خمسة جاذبية جيدة التغذية على كل طبق NGM يبلغ طوله ستة سنتيمترات مع منتقي دودة بلاتينية واتركها تضع حوالي 50 بيضة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة للحصول على مجموعة متزامنة من الحيوانات البالغة. لوقف وضع البيض ، قم بإزالة الحيوانات الأم من الأطباق باستخدام منتقي دودة البلاتين. قم بزراعة الحيوانات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة أيام تقريبا للوصول إلى مرحلة البلوغ الناضجة ، وليس مرحلة الشباب.

بعد خمسة أيام ، اجمع حوالي 200 بالغ في جامع عن طريق غسل كل طبق بملليلتر واحد من الجيلاتين المائي بنسبة 0.25٪ مما يمنع التصاق الحيوانات بسطح البلاستيك ، مثل أطراف الماصة. بعد ذلك ، اغسل الحيوانات عن طريق تحريك المجمع برفق لأعلى ولأسفل مرتين في 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج. كرر العملية مرتين.

اغمر بلطف جامع الحيوانات الذي يحتوي على حوالي 200 في 40 ملليلتر من خليط من 1٪ 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك عند درجة الحموضة 4 في طبق تبلور لمدة ثانية واحدة. اغسل الحيوانات في المجمع عن طريق غمر المجمع بلطف شديد مرة واحدة في بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والتي تحتوي على 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج. ثم ضع المجمع على حديقة E.coli OP50 على لوحة NGM بطول ستة سنتيمترات لمدة 10 دقائق حتى تستريح الحيوانات.

بعد ذلك ، اغسل الحيوانات في المجمع ب 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج عن طريق تحريك المجمع برفق لأعلى ولأسفل. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات وانتقل إلى فحص الانجذاب الكيميائي. اغسل الحيوانات بالتتابع في جامع بمزيج البروبانول والماء المقطر المزدوج ، مرة واحدة كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، ضع المجمع على حديقة E.coli OP50 على أجار NGM في طبق بتري يبلغ طوله ستة سنتيمترات لمدة 10 دقائق حتى تستريح الحيوانات. بعد ذلك ، اغسل الحيوانات ثلاث مرات عن طريق تحريك المجمع برفق لأعلى ولأسفل مرتين في 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج لمنع التلوث البكتيري وانتقل إلى فحص الانجذاب الكيميائي. تحضير لوحات اوجير لمقايسة الانجذاب الكيميائي في أطباق بتري البلاستيكية ستة سنتيمترات.

ثم استخدم طرف ماصة منشور له فتحة تزيد عن ملليمتر واحد لنقل الحيوانات من المجمع إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من الجيلاتين المائي بنسبة 0.25٪. بعد أن تستقر الحيوانات في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية ، قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب. أعد تعليق الحيوانات في ملليلتر واحد من محلول مقايسة الانجذاب الكيميائي ، واتركها تستقر بالجاذبية إلى قاع الأنبوب لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، حدد قطريا أربعة ميكرولترات من 1-بروبانول مائي بنسبة 5٪ في مكانين ، ثم اكتشف أربعة ميكرولترات من الماء المقطر المزدوج في مكانين آخرين في صفيحة بتري. ثم استخدم طرف ماصة منشور بفتحة ملليمتر واحد لتحديد ستة ميكرولترات من تعليق الحيوان في مخزن مقايسة الانجذاب الكيميائي الذي يحتوي على حوالي 60 حيوانا في وسط ثلاث لوحات.

قم بإزالة السائل قدر الإمكان باستخدام فتيل مناديل المختبر دون لمس الحيوانات. ضع غطاء على اللوحة واترك الحيوانات تتحرك بحرية على اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لإيقاف الانجذاب الكيميائي ، انقل هذه اللوحة إلى طبق بتري زجاجي على الجليد لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، ضع الطبق في الثلاجة حتى حساب عدد الحيوانات على اللوحة. احسب عدد الحيوانات في أربعة أقسام باستثناء تلك الموجودة في الدائرة المركزية تحت مجهر ستيريو ، واحسب مؤشر الانجذاب الكيميائي باستخدام المعادلة. من قيم مؤشر الانجذاب الكيميائي ، احسب قيم مؤشر التعلم على أنها الفرق بين قيمة مؤشر الانجذاب الكيميائي للحيوانات المرجعية وقيمة مؤشر الانجذاب الكيميائي للحيوانات المكيفة.

في فحص الانجذاب الكيميائي ، لا تنجذب الحيوانات المكيفة بمزيج من 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك إلى 5٪ 1-بروبانول المرقط على ألواح أجار ، في حين أن الحيوانات الساذجة والمرجعية انجذبت إلى 5٪ 1-بروبانول. لم تعد الحيوانات المشروطة بالتدريب المتباعد بمزيج من 1-بروبانول المائي وحمض الهيدروكلوريك تنجذب إلى 5٪ 1-بروبانول مقارنة بالحيوانات المعالجة ب 1٪ 1-بروبانول أو حمض الهيدروكلوريك ، أو الماء المقطر المزدوج فقط. كشفت دراسة تأثير الطفرات على الذاكرة أن تكوين الذاكرة قصيرة المدى وطويلة المدى يعتمد على الجينات التي تلعب أدوارا أساسية في التكييف الكلاسيكي للحيوانات.

بعد كل تكييف ، يجب غسل الحيوانات بلطف مرة واحدة فقط بالماء المقطر المزدوج. بعد تكوين الذاكرة طويلة المدى باستخدام الإجراء ، يمكن لتصوير الكالسيوم والفيزيولوجيا الكهربية تحديد الدوائر العصبية المسؤولة عن الذاكرة. من خلال التحليلات الجينية والخلايا العصبية المفردة ، يمكن معالجة عمليات تخزين الذاكرة واسترجاعها على المستويات الجزيئية والخلية الواحدة.