تقنية حقن الأجنة لتحرير الجينات في القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis

هذا هو أول بروتوكول لحقن الجنين لأنواع Chelicerata. ستفتح القدرة على حقن أجنة القراد العديد من خطوط البحث ، على وجه الخصوص ، الدراسات في وظيفة جين القراد وتفاعلات مسببات القراد. تسمح هذه التقنية بالعمل المستقبلي على الدراسات الوظيفية لجينات القراد وتوفر أساسا للتحكم في أعداد القراد باستخدام أنظمة محرك الجينات.

ستسهل هذه الطريقة فهم التفاعل بين القراد ومسببات الأمراض التي تؤويها على المستوى الجزيئي. سيسمح لنا ذلك بتحديد البروتينات التي يمكن استخدامها لتطوير لقاحات لمرض لايم ومسببات الأمراض الأخرى. في حين أن العديد من مجالات البحث مثل تفاعلات مسببات القراد وانتقال مسببات الأمراض إلى المضيفين عن طريق القراد أثناء التغذية ستستفيد من هذا العمل.

يمكن الآن فهم المزيد من الأسئلة الأساسية مثل كيف يتهرب القراد من الاستجابة المناعية للمضيف ، والاختلافات في آليات إصلاح الحمض النووي. هناك بعض جوانب بيولوجيا القراد التي يجب فهمها قبل تنفيذ هذا الإجراء. يؤدي الضغط الداخلي المرتفع للجنين إلى الانفجار عند لمسه بواسطة إبرة.

من المهم جدا تحضير الأجنة للحقن. للبدء ، انقل الإناث من أربع درجات مئوية إلى حاضنة 27 درجة مئوية لبدء وضع البيض قبل أسبوع من الحقن. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام عندما تبدأ الإناث في وضع البيض ، قم بإزالة أي بيض باستخدام فرشاة رسم ذات رؤوس دقيقة أثناء تحضير الإناث لاستئصال أعضاء جين.

لتفريغ الغدة ، رتب القراد الجاذب على شريحة زجاجية تحت المجهر بطريقة تجعل أجزاء الفم مرئية على الجانبين البطني والظهري. ثم ثقب بعناية المنطقة خلف أجزاء الفم على الجانب الظهري ، والضغط على الجانب البطني باستخدام ملقط. ضع حافة منديل خال من النسالة وقم بإزالة الشمع السائل الخارج من موقع البزل.

بدلا من ذلك ، بدلا من إفراغ الغدة عن طريق التشريح ، يمكن استخدام المواد اللاصقة مثل لاصق الأنسجة حول أجزاء فم القراد. عندما تبدأ الإناث في وضع البيض مرة أخرى ، استخدم فرشاة رسم دقيقة لجمع البيض المترسب حديثا ووضعه في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من ماء كلوريد البنزالكونيوم 5٪ في الأنبوب الذي يحتوي على بيض عمره صفر إلى 18 ساعة.

حرك البيض برفق باستخدام فرشاة الرسم لمدة خمس دقائق لتجنب استقرار البيض في قاع الأنبوب ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة ، تاركا البيض خلفه في الأنبوب. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من الماء المقطر إلى الأنبوب الذي يحتوي على البيض. قم بالدوران باستخدام فرشاة الرسم وقم بإزالة الماء من أنبوب الطرد المركزي الصغير باستخدام ماصة صغيرة.

بعد الغسيل بالماء المقطر ، أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم بنسبة 5٪ وقم بتحريكه برفق باستخدام فرشاة الرسم لمدة خمس دقائق. ثم أخرج المحلول من الأنبوب بعد خمس دقائق ، واغسل البيض مرتين بالماء المقطر. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 1٪ في أنبوب الطرد المركزي الصغير الذي يحتوي على البيض.

أولا ، قم بلصق شريحتين مجهريتين زجاجيتين معا ، تاركا فجوة تبلغ حوالي 0.5 سم لدعم محاذاة البيض باستخدام شريط على الوجهين ، وقم بتطبيق قطعة من ضمادة الفيلم الشفافة على الشريط على الوجهين في الفجوة بين الشرائح. ثم قم بمحاذاة ثماني إلى 10 بيضات في المرة الواحدة على إعداد الشريحة باستخدام فرشاة الرسم. ثم ضع الشريحة مع البيض المحاذي على مرحلة المجهر المركب وقم بإزالة محلول كلوريد الصوديوم 1٪ باستخدام قطعة من المناديل الخالية من النسالة التي يتم تخزينها فيها.

قم بتوصيل إبرة الحقن المملوءة بحاقن دقيق متصل بمناور صغير. بعد ذلك ، افتح الإبرة عن طريق فركها برفق على سطح البيضة باستخدام إعداد ضغط مرتفع على الحاقن الدقيق. بعد فتح الإبرة ، قلل ضغط الحاقن الصغير اعتمادا على فتحة الإبرة.

ثم قم بحقن جميع البيض على الشريحة بزاوية 10 إلى 15 درجة في أسرع وقت ممكن ، واضغط بسرعة على دواسة القدم ، وحرك الشريحة على الفور إلى ظروف الرطوبة العالية في طبق بتري بمنشفة ورقية رطبة. بعد خمس إلى ست ساعات من وضع الشريحة التي تحتوي على أجنة محقونة في طبق بتري كبير مبطن بورق ترشيح رطب ، أضف قطرة صغيرة من الماء المقطر إلى ضمادة الفيلم الشفافة مع الأجنة المحقونة المرفقة. ثم قم بإزاحة البيض برفق باستخدام فرشاة الرسم.

بعد ذلك ، انقل البيض إلى طبق بتري صغير واغمره في الماء المقطر. احتفظ بالبيض مغمورا في الماء ، ضع طبق بتري في صندوق بلاستيكي سعة ستة لترات في حاضنة عند 27 درجة مئوية عند رطوبة نسبية تزيد عن 90٪. عندما تبدأ اليرقة في الفقس من الأجنة المحقونة بعد 21 إلى 25 يوما من الحقن ، افحصها يوميا وانقل أي يرقات فقس إلى قوارير زجاجية مع شاشة في الأعلى.

أظهرت النتائج أن حقن البويضات في وقت مبكر من التطور الجنيني من 12 إلى 18 ساعة ، ومحاذاة المحور الأطول للبيضة بشكل عمودي على حافة الشريحة يؤدي إلى معدل بقاء أعلى للبويضات المحقونة. من بين جميع البيض المحقون ، نجا ما يصل إلى 8.5 ٪ وفقس اليرقة. قبل البدء في هذا الإجراء ، من المهم تذكر الخطوات 2.4 ، إزالة الشمع من القراد الأم ، والخطوات من 3.1 إلى 3.4 ، تليين مشيمية الجنين باستخدام كلوريد البنزالكونيوم ، وتجفيف الجنين بمحلول كلوريد الصوديوم لتمكين حقن الجنين بنجاح.

تم تطوير هذه الطريقة في المقام الأول لتحرير جين القراد ، وهذا سيسمح لنا بإجراء ضربات قاضية وضربات قاضية تساعدنا على فهم وظيفة جين القراد. ستسمح هذه التقنية باستخدام أدوات تحرير الجينات المتاحة للعديد من الكائنات الحية الأخرى ليتم تطبيقها على أبحاث القراد. وهذا سوف يسرع أبحاث البيولوجيا الجزيئية القراد.