عزل وإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفئران

الخلايا النجمية هي مجموعة ذاتية المنشأ مثيرة للاهتمام لاستهدافها للبرمجة العصبية المباشرة. يوفر هذا البروتوكول تقنية موثوقة لعزل الخلايا النجمية المستزرعة ذات النقاء العالي من مناطق مختلفة أو الجهاز العصبي المركزي. تم تصميم هذا البروتوكول وتحسينه للتحقيق في قدرة الخلايا النجمية على إعادة برمجتها إلى خلايا عصبية وظيفية دون عوامل مربكة مثل الاختلافات في نقاء الخلايا النجمية لمختلف مجموعات الشركات الناشئة.

سيتم عرض الإجراء من قبل بوب هيرسباخ ، ما بعد الدكتوراه في المختبر ، وتاتيانا سيمون مساعدة فنية في مختبرنا. للبدء ، ضع جذع فأر القتل الرحيم في طبق بتري 35 ملم واحتفظ به على الجليد. افتح الجلد بالمقص وأزل الفقرة بمقص صغير.

ثم استخراج الحبل الشوكي ووضعه في مخزن تشريح مؤقت على الجليد. تحت مجهر تشريح التجسيمي مع تكبير مرتين ، قم بإزالة السحايا من الحبل الشوكي المعزول باستخدام ملقط ونقل أنسجة الحبل الشوكي المشوهة والنظيفة إلى أنبوب C. أضف 50 ميكرولتر من إنزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية و 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المعد مسبقا إلى كل أنبوب C.

قم بعكس الأنابيب C وضعها على جهاز منفصل ساخن لضمان جمع جميع الأنسجة في غطاء الأنبوب. تهرب من الخلايا عن طريق إزالة العمود من الفاصل بإضافة 800 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا النجمية ودفع الخلايا خارج العمود باستخدام المكبس المضمن. خلايا الصفائح في قوارير المزرعة المعدة مسبقا عن طريق إضافة 4.2 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجمية مع استكمال 10 نانوغرام لكل ملليلتر من EGF و bFGF.

ليس من الضروري تغطية قوارير الثقافة للخلايا النجمية المعزولة عن مناطق الدماغ الأخرى ولكنها توفر ركيزة أفضل للخلايا النجمية المعزولة من الحبل الشوكي. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء مقاعد الخلايا النجمية تحت خزانة السلامة البيولوجية مع مستوى السلامة الأول وقم بإعداد 24 لوحة بئر مع زلات غطاء زجاجي مطلي ب Poly-D-Lysine كما هو موضح في مخطوطة النص.

للطلاء ، عزل ستة حبال شوكية من الفئران P2 تنتج حوالي 1 مليون خلية. استنشق الوسائط من قوارير الثقافة T-12.5 التي تحتوي على الخلايا النجمية المستزرعة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS. افصل الخلايا النجمية عن قارورة الاستزراع بإضافة 0.5 ملليلتر من 0.05٪ من التربسين EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

اضغط برفق على جانب القارورة لإطلاق الخلايا من سطح قارورة المزرعة وتحقق من الانفصال تحت مجهر ساطع باستخدام تكبير 10 مرات. توقف عن التربسيناز باستخدام 2.5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجمية وجمع تعليق الخلايا في أنابيب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 300 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

شفط الخلايا الفائقة وإعادة إرسالها في ملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا النجمية. احسب تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي. بناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية بوسط الخلايا النجمية الطازج المكمل ب EGF و bFGF بمعدل 10 نانوغرام لكل ملليلتر لكل عامل.

أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من 24 لوحة بئر تم إعدادها مسبقا وخلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. تحضير وسط التمايز العصبي عن طريق إضافة ملليلتر واحد B27 الملحق إلى 49 ملليلتر من وسط الثقافة الأساسية. بعد 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على ما إذا كانت الخلايا قد تم نقلها أو نقلها ، استبدل وسط الخلايا النجمية بوسط تمايز عصبي واحد ملليلتر لكل بئر.

زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 9٪ من ثاني أكسيد الكربون. لزيادة كفاءة إعادة البرمجة ، استكمل وسط التمايز العصبي بفورسكولين ودورسومورفين إلى تركيز نهائي من 30 ميكرومولار وميكرومولار واحد على التوالي عند استبدال وسط الخلايا النجمية بوسط التمايز. عند اختيار علاج الخلايا مع فورسكولين ودورسومورفين توفير جرعة ثانية من دورسومورفين بعد يومين من العلاج الأولي.

أضف هذا العلاج الثاني مباشرة إلى وسط الثقافة. وصلت الثقافات الأولية للخلايا النجمية إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء بين سبعة إلى 10 أيام بعد فرز الخلايا بمساعدة مغناطيسية وطلائها. في اليوم التالي للطلاء ، تغطي الخلايا عادة 50 إلى 60٪ من سطح انزلاق الغطاء.

تألفت الثقافات بشكل رئيسي من الخلايا النجمية في هذه المرحلة ، في حين أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الانفجارات العصبية كانت غائبة تقريبا. في سبعة أيام بعد النقل أو النقل ، كانت الخلايا العصبية المستحثة مميزة بوضوح عن الخلايا النجمية. كانت سوما الخلايا العصبية أصغر من الخلايا النجمية غير المعاد برمجتها لديها عمليات طويلة وكانت إيجابية لعلامة الخلايا العصبية ، بيتا ثلاثة توبولين ، وسلبية لعلامة الخلايا النجمية GFAP.

في 21 يوما بعد النقل أو النقل ، كانت العديد من الخلايا العصبية المستحثة قادرة على إطلاق إمكانات العمل وكانت إيجابية للعلامة العصبية الناضجة NeuN والبروتين المشبكي الشامل Synaptophysin. من الضروري تشريح المنطقة ذات الاهتمام بشكل صحيح. تجنب التلوث من الأنسجة المحيطة.

يجب توخي الحذر لإزالة السحايا والعقد الجذرية الظهرية من الحبل الشوكي المعزول. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا النجمية عن مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك القشرة الدماغية والدماغ الأوسط الظهري والمخيخ. في المستقبل ، ستسمح لنا هذه التقنية بتوسيع معرفتنا بالخلايا النجمية الإقليمية وإمكانية إعادة برمجتها إلى خلايا عصبية وظيفية.