تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo
يوليو 6, 2022
باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.
بروتوكولنا هو طريقة في الجسم الحي للتحقيق في وظائف الخلية المستقلة ل FMRP أثناء التطوير. يمكن أن يساعد ذلك في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بنوع الخلية لمتلازمة X الهشة. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل مستحث للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1.
بهذه الطريقة ، نحقق ضربة قاضية FMRP الانتقائية في الدائرة السمعية. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة وظيفة الجينات الأخرى في الدائرة السمعية أو الجهاز الدهليزي. ابدأ بوضع البويضات أفقيا لوضع الجنين على قمة البويضة لسهولة التلاعب بها.
احتضن عند 38 درجة مئوية لمدة 46 إلى 48 ساعة حتى هامبرغر وهاملتون ، أو HH المرحلة 12 ، لنقل الأنبوب العصبي أو لمدة 54 إلى 56 ساعة حتى HH 13 لنقل كيس الأذن. إزالة البيض من الحاضنة ، دزينة من البيض في وقت واحد. يؤدي إبقاء البيض خارج حاضنته لأكثر من ساعة إلى حدوث اختلافات في النمو ويقلل من قابليته للحياة.
استخدم مصباحا يدويا لإلقاء الضوء من قاع البيضة. يظهر موقع الجنين كمنطقة مظلمة على قشر البيض. بمناسبة موقع الجنين على قشر البيض بقلم رصاص.
امسح البيض بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول وحفر حفرة في الطرف المدبب للبيض باستخدام طرف المقص. بعد ذلك ، قم بإزالة ملليلتر من الألبومين باستخدام حقنة إبرة قياس 18. تأكد من أن الفتحة كبيرة بما يكفي للسماح بإدخال الإبرة.
امسح أي ألبومين متسرب بالشاش وأغلق الفتحة بشريط شفاف. قم بتغطية الجزء العلوي من البيض بشريط شفاف ، مع التركيز على المنطقة الداكنة التي تحمل علامة قلم رصاص لتقليل التشققات ومنع سقوط حطام القشرة أثناء النوافذ. امسح جميع أدوات الجراحة بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول وامسح المنطقة المغطاة بالشريط بنسبة 75٪ إيثانول.
استخدم مقصا صغيرا لقص نافذة من سنتيمتر إلى سنتيمترين مربعين حول محيط علامة القلم الرصاص. امسك المقص بشكل مسطح لتجنب إتلاف الجنين تحته. ضع البيضة ذات النوافذ تحت مجهر مجسم مع قطعة عين 10X وتكبير 2X.
املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بمحلول الحبر ثم قم بتركيب إبرة قياس 27. ثني الإبرة بزاوية 45 درجة بالملقط. تحت المجهر ، كزة بعناية من حافة المنطقة معتمة وأدخل الإبرة تحت الجنين.
حقن حوالي 50 ميكرولتر من الحبر ، والتي سوف تنتشر تحت المنطقة pellucida ، لتصور الجنين. سيشكل الحبر خلفية داكنة للتصور الواضح للجنين. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية إلى ماصات باستخدام مجتذب ماصة.
تحت مجهر تشريح ، افتح بعناية طرف الإبرة الشعرية إلى قطرها من 10 إلى 20 ميكرومتر باستخدام ملقط. قم بتخزين الماصات في صندوق تخزين حتى الاستخدام. بعد ذلك ، املأ ماصة شعرية ب 0.5 إلى 1 ميكرولتر من خليط البلازميد عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال أنبوب مطاطي في نهاية الماصة باستخدام حقنة.
ضع البويضة تحت المجهر بحيث يكون الجنين موجها رأسيا مع الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية بيد واحدة أو باستخدام مناور ثلاثي المحاور وادفع طرف الماصة إلى المعين من 5 إلى 6. في اتجاه الذيل إلى الرأس.
قم بوخز الطرف برفق عبر غشاء vitellin إلى الأنبوب العصبي الظهري ، ثم اسحب الماصة قليلا بحيث يكون الطرف في تجويف الأنبوب العصبي. حقن خليط البلازميد عن طريق الضغط على الهواء حتى ينتشر البلازميد الملون بالكامل في المعين 5 إلى 6 ويمتد إلى المعين 3 والمعين 4. تحقق من نجاح الحقن ، والذي يتحقق عندما ينتشر محلول البلازميد الأزرق بسرعة أسفل الأنبوب العصبي دون تسرب.
عندما يحدث تسرب ، يتلاشى اللون الأزرق بسرعة. بعد الحقن مباشرة ، ضع قطبا كهربائيا ثنائي القطب من البلاتين على جانبي الأنبوب العصبي. قم بتوصيل نبضتين بجهد 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية باستخدام جهاز كهربائي.
راقب فقاعات الهواء في نهايات القطب ثنائي القطب ، مع وجود المزيد على الجانب السلبي. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الملون إلى نسيج الأنبوب العصبي بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية.
قم بتغطية النافذة الموجودة على قشر البيض بقطعة من الفيلم الشفاف المقطوع مسبقا إلى مربعات بحجم بوصتين ورشها بنسبة 75٪ من الإيثانول. ضع البيضة مرة أخرى في حاضنتها. نظف القطب ثنائي القطب عن طريق توصيل 10 إلى 20 نبضة من 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية في محلول ملحي قبل الانتقال إلى البويضة التالية.
تحت المجهر ، ضع البويضة بطريقة تجعل الجنين عموديا مع الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية وكزة كيس الأذن الأيمن برفق في الاتجاه الظهري الجانبي. حقن خليط البلازميد بضغط الهواء حتى تمتلئ كيس الأذن بمحلول أزرق.
تحقق من نجاح الحقن، والذي يتحقق عندما يكون خليط البلازميد الأزرق محصورا داخل الكيسة الأذنية ولا يتسرب. مباشرة بعد الحقن ، ضع القطب ثنائي القطب على كيس الأذن وضع الجانبين الإيجابي والسلبي الأمامي والخلفي للكيس الأذني ، على التوالي. قم بتوصيل نبضتين بجهد 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي.
تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الأزرق إلى أنسجة كيس الأذن بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية وقم بتغطية النافذة على قشر البيض بفيلم شفاف. أخيرا ، أعد البويضة إلى الحاضنة.
توضح الصورة التمثيلية مثالا لليوم الجنيني الثالث، أو E3، بعد نقل الأنبوب العصبي وعلاج دوكس في اليوم الجنيني الثاني، أو E2. تظهر هنا الخلايا المنقولة باستخدام Fmr1 shRNA و EGFP على المقطع العرضي. اقتصرت الخلايا المعبرة عن EGFP على جانب واحد من الأنبوب العصبي وجذع الدماغ. يظهر هنا مقطع عرضي عند E15 مع نواة ماغنوسيلواريسية معبرة عن EGFP، أو الخلايا العصبية NM، على الجانب المنقول.
على الجانب المقابل، شوهدت محاور عصبية تحتوي على EGFP في الجزء البطني من النواة الصفيحية، أو NL. تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال تخفيضات ملحوظة في النشاط المناعي FMRP في الخلايا العصبية NM المنقولة مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة. تظهر هنا العقدة السمعية في E19 مع النشاط المناعي FMRP. لم يتم نقل الخلايا العصبية العقدية السمعية.
تم نقل بعض الخلايا الدبقية المشتقة من خلايا القمة العصبية القحفية. تظهر الصور التمثيلية ضربة قاضية FMRP في القناة السمعية بعد نقل كيس الأذن. أظهرت القنوات السمعية في E9 مضان EGFP واسع النطاق.
في المقاطع المستعرضة ، كانت الخلايا المعبرة عن EGFP موجودة في الحليمة القاعدية والعقدة السمعية. تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال انخفاض النشاط المناعي FMRP في خلايا الشعر المنقولة مقارنة بخلايا الشعر المجاورة غير المنقولة. وبالمثل ، تضاءل النشاط المناعي FMRP إلى حد كبير في الخلايا العصبية العقدية السمعية المنقولة.
تم تتبع الإسقاط المركزي للخلايا العصبية العقدية السمعية المنقولة إلى جذع الدماغ عبر العصب السمعي مع أطراف المصباح المميز. أثناء محاولة هذا الإجراء ، فإن أهم شيء هو التحكم في موقع واتجاه التثقيب الكهربائي للنقل الانتقائي. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء ملء نوع الخلية الواحدة ، أو التلوين المناعي ، أو فرز الخلايا متبوعا بطيف الكتلة ، أو تسلسل الخلية الواحدة للكشف عن التغييرات على المستويات المورفولوجية والكيميائية الحيوية.
تتيح هذه التقنية أيضا التحرير الانتقائي للجينات الأخرى مع التحكم الزمني وخصوصية المكونات في الأذن السمعية للدوائر الجذعية ويمكن تعديلها للتعامل مع النظام الدهليزي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة طريقة في الجسم الحي باستخدام الكهربائي داخل البيض لتحقق انخفاضًا محددًا لمجموعة الخلايا لبروتينات تأخر النمو العقلي الهش (FMRP) في أجنة الدجاج. تستهدف المنهجية بشكل خاص الأذن الداخلية السمعية والنواة القوقعية خلال مراحل تجميع الدائرة، مما يعزز فهمنا للوظائف الخلوية المتعلقة بمتلازمة هش اكس.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم الوراثة
الخلفية
- يرتبط متلازمة هش اكس بالطفرات التي تؤثر على FMRP، وهي مهمة للتطور العصبي.
- يمكن أن يؤدي فهم وظائف FMRP النوعية للخلية إلى توضيح الآليات التنموية والفيزيولوجيا المرضية.
- الدراسات السابقة لم تتمكن بشكل فعال من التمييز بين أدوار FMRP عبر مجموعات الخلايا العصبية المختلفة.
- يسمح الكهربائي داخل البيض بالتدخل الدقيق أثناء التطور الجنيني.
هدف الدراسة
- تطوير تقنية كهربائي انتقائية لاستهداف مناطق معينة في الدماغ.
- للتحقيق في آثار انخفاض FMRP على تكوين الدائرة السمعية.
- تسهيل البحوث المستقبلية على جينات أخرى داخل الأنظمة السمعية والحسية الدهليزية.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الدراسة الكهربائي داخل البيض لإدخال RNA الشعري الصغير المستهدف لـ Fmr1 في أجنة الدجاج.
- تشمل المناطق المستهدفة الدائرة السمعية والمناطق الحرجة مثل الرومبوميرات 5 إلى 6.
- تتضمن الجداول الزمنية فترات حضانة محددة للمراحل التنموية الدقيقة.
- يتم إجراء الكهربائي باستخدام قطب كهربائي ثنائي القطب من البلاتين لفعالية امتصاص البلازميد.
النتائج الرئيسية
- يعزز الانخفاض الناجح لـ FMRP فهم الآليات الخلوية أثناء تجميع الدوائر السمعية.
- أدى الكهربائي إلى تسليم فعال لمخاليط البلازميد، والتي يمكن ملاحظتها من خلال انتشار البلازميد الأزرق.
- لوحظت تغييرات خلوية وهيكلية واضحة في الدائرة السمعية بعد النقل الجيني.
- تدعم الاستنتاجات دور FMRP في تنظيم تجميع الدوائر في مجموعات الخلايا العصبية المحددة.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة طريقة قوية للتحقيق في الأدوار العصبية لـ FMRP في التطور الجنيني.
- تساهم النتائج برؤى قيّمة في الآليات الجزيئية الكامنة وراء متلازمة هش اكس.
- تمتد الآثار إلى فهم ديناميكيات الدائرة والتدخلات المحتملة في الاضطرابات ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precise dissection of cell-autonomous gene function in neural circuits is critical for de-risking target validation in neurodevelopmental disorder pipelines. The described in ovo electroporation method enables temporally controlled, component-specific FMRP knockdown, supporting predictive confidence in early-stage target interrogation. This approach enhances portfolio decision-making by enabling within-animal controls and high-resolution mechanistic insights relevant to fragile X syndrome and related pathologies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function at the level of individual neural circuit components.
- Supports biological de-risking by isolating cell-autonomous effects from systemic influences.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows for within-animal controls, increasing data reliability and sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, mosaic biological systems for downstream phenotypic or molecular assays.
- Enables reproducible, quantitative assessment of gene knockdown effects in defined cell populations.
- Supports assay standardization through spatial and temporal control of gene editing.
- Provides a platform for scalable screening of gene function in neural circuits.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling FMRP loss in auditory circuits implicated in fragile X syndrome.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of candidate targets.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying circuit-level consequences of gene perturbation.
- Facilitates biomarker discovery through integration with single-cell sequencing or proteomics.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stages, bridging mechanistic hypothesis testing with preclinical model development for neurodevelopmental disorders.
- Discovery Biology: Provides high-resolution analysis of gene function in specific neural circuit components.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing gene knockdown versus control within the same animal.
- Analytics: Enables measurement of protein expression, neuronal connectivity, and circuit assembly outcomes.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant phenotypes in fragile X syndrome models.
- Enterprise Reuse: Adaptable for selective editing of other genes and circuits, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes gene editing with spatial, temporal, and cell-type specificity.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying target effects early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental disorder programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, neural circuit anatomy, and in vivo gene editing.
- Demands access to electroporation equipment, imaging platforms, and molecular validation tools.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for developmental timing and tissue accessibility.
- Potential limitations include developmental variability and off-target effects, requiring careful experimental controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Egg Preparation
2:30
Egg Windowing and Embryo Identification
3:39
Neural Tube Injection and Electroporation
6:20
Otocyst Injection and Electroporation
7:44
Results: FMRP Knockdown in the Chicken NM and Auditory Duct and Axonal Tracking of Transfected AG Neurons in the Brainstem
10:18
Conclusion
