بروتوكولات كريسبر / كاس 9 طفرات ذبابة الفاكهة الشرقية باكتروسيرا الظهرية

ذبابة الفاكهة الشرقية هي نوع من الآفات الغازية للغاية والتكيفية. يمكن أن تساعدنا الطرق الفعالة لأبحاث الجينات الوظيفية في تطوير استراتيجيات إدارة الآفات الصديقة للبيئة. هذه الطريقة عالية الكفاءة ومنخفضة التكلفة.

سيكون بروتوكولنا بمثابة دليل مفيد لتوليد الذباب الطافر للباحثين في ذبابة الفاكهة الشرقية. للبدء ، توقع بنية الجينات المستهدفة ذات الأهمية وحدد الحدود بين الإكسونات والإنترونات عبر التحليل المعلوماتي الحيوي لجينوم Bactroceras dorsalis. استخدم مجموعة توليف gRNA المتاحة تجاريا لإنشاء sgRNA المصمم.

أعد تعليق منتج gRNA في ماء خال من النيوكلياز. حدد التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية قبل الاستخدام. ضع الشرانق B.dorsalis في قفص بلاستيكي ، مع حالة تربية تبلغ 55٪ رطوبة نسبية ، و 26.5 درجة مئوية ، ودورة ضوئية / يوم 14:10.

عندما يغلق البالغون ، قدم مزيجا من السكر والخميرة كغذاء مع الماء. يصل معظم البالغين إلى مرحلة النضج الجنسي بعد 10 أيام من ظهورهم. استخدم حاملا خفيفا بضوء من 30 إلى 50 لوكس لتحسين خصوبة الإناث ، وبالتالي تحسين كفاءة جمع الأجنة.

بعد ذلك ، ضع شاشا من 200 شبكة في غرفة وضع البيض ، على بعد حوالي 1 إلى 2 ملم من غطاء الغرفة. ضع حجرة جديدة لوضع البيض في القفص عندما يكون إعداد الحقن المجهري جاهزا. اجمع الأجنة كل 10 دقائق باستخدام فرشاة مبللة دقيقة واصطفها على طبق حقن عصامي.

اغمس الأجنة في زيت الهالوكربون أثناء الحقن لتجنب المزيد من الجفاف. تحضير حل العمل عن طريق خلط بروتين Cas9 و sgRNA المقابلة لتركيز 300 نانوغرام لكل ميكرولتر من كل منهما. ثم أضف 1 ميكرولتر من الفينول الأحمر إلى الخليط ليكون بمثابة طريقة ملائمة لتمييز الأجنة المحقونة.

ضع الخليط المحضر على الثلج لتجنب تدهور sgRNA. تحضير إبرة حقن الزجاج باستخدام مجتذب micropipette. أضف 3 ميكرولتر من الخليط إلى إبرة الحقن دون إدخال فقاعات هواء.

بعد ذلك ، افتح الإبرة باستخدام Microgrinder وقم بتوصيلها بالمعالج الدقيق وفقا لدليل المستخدم. اضبط معلمات الحاقن ك Pi على 500 هيكتوباسكال. Ti إلى 0.5 ثانية ، والكمبيوتر الشخصي إلى 200 هيكتوباسكال.

ضع الطبق مع أجنة مصطفة على طاولة الهدف. بعد ذلك ، اضبط موضع الماصة الدقيقة تحت مجهر بصري دقيق ، مع وضع الماصة الدقيقة والجنين على نفس المستوى. أدخل طرف الإبرة في القطب الخلفي أو النباتي، للجنين.

ثم اضغط على الدواسة من الحاقن لتوصيل المخاليط إلى الجنين. يرجع ظهور اللون المحمر الطفيف إلى إضافة الفينول الأحمر في الخليط. ضع لوحة الحقن مع الأجنة المحقونة في غرفة مناخ اصطناعي.

بعد 36 ساعة ، انقل اليرقات المفرغة إلى نظام غذائي لليرقات باستخدام فرشاة دقيقة. اجمع اليرقات ثلاث أو أربع مرات يوميا حتى لا تفقس المزيد من اليرقات. بعد ذلك ، ضع اليرقات الناضجة في الرمال الرطبة لتشرنق.

تستغرق مرحلة التشرنق 10 أيام. بعد التشرد ، انقل الشرانق إلى قفص بلاستيكي قبل أن يبدأ الانكسار. بعد عزل الحمض النووي الجينومي من بوباريوم طازج أو ساق واحدة في منتصف الساق من البالغين الفرديين وتصميم البادئات المحددة لتضخيم المنطقة المستهدفة ، قم بإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، أو PCR ، وفقا لظروف الدورة الموضحة في مخطوطة النص.

ثم قم بتسلسل منتجات PCR المنقى. يشير اكتشاف العديد من القمم المتداخلة المجاورة للموقع المستهدف إلى نجاح الطفرات. بالنسبة للاستنساخ الفرعي ، امزج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى مع ناقل غير حاد وقم بربطها عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف خلايا trans-T1 وضعها على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم ، إضافة 500 ميكرولتر من LB المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز. أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات وانشرها على لوحة LB. ضع الطبق للحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، حدد المستعمرات البكتيرية الفردية للتسلسل للتحقق من النمط الجيني للطفرات.

في هذه الدراسة ، يقع مثال الموقع المستهدف للجين المختار في إكسون الثالث. الموقع المستهدف محفوظ للغاية ، وتم اكتشاف نطاق واحد عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي لقالب الحمض النووي ل gRNA الاصطناعية و gRNA التي تم الحصول عليها في النسخ المختبري. B.dorsalis البقاء على قيد الحياة والطفرات بعد الحقن المجهرية موضحة هنا.

بعد تسلسل منتجات PCR ، 80٪ من أفراد G0 هم طفرات فسيفساء. في فحص الطفرات ، أدى الطفرة مع حذف 8 أزواج قاعدية إلى إنهاء سابق لأوانه لترجمة الأحماض الأمينية. يعد إدخال الإبرة في المنطقة الخلفية أو القطب النباتي للجنين خطوة مركزية لأن هذا يؤثر بشكل مباشر على بقاء البويضات.

توفر هذه التقنية مرجعا لدراسة مجالات وظائف الجينات في B.Dorsalis يمكنهم التقاط الطفرات التي يريدونها بسرعة من خلال هذه الطريقة.