تقييم ومعالجة النشاط العصبي باستخدام المجهر المجسم ثنائي الفوتون

يوفر هذا البروتوكول معلومات زمنية مكانية دقيقة عن النشاط العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على معالجة وتقييم النشاط العصبي بدقة زمنية مكانية عالية. قد يكون مفيدا لتوضيح مسببات الأمراض للاضطرابات العصبية والنفسية التي تؤدي إلى تشوهات في النشاط العصبي.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة الخلايا العصبية وكذلك الصحة في الأعضاء الأخرى. سيكون إظهار الإجراء Zhongtian Guo ، طالب دراسات عليا دكتوراه من مختبرنا. بعد يوم واحد من زرع لوحة الرأس ، يتم تطبيق 1.32 ملليغرام لكل كيلوغرام من ديكساميثازون فوسفات الصوديوم داخل الصفاق قبل ساعة واحدة من الجراحة لتجنب الوذمة الدماغية.

تحت مجسمة ، قم بإجراء حج القحف الدائري الذي يبلغ قطره حوالي ملليمترين باستخدام مثقاب الأسنان. لتقليل تلف الدماغ ، قم بتشغيل مثقاب الأسنان بعناية مع حركة طفيفة ثابتة وضغط خفيف لأسفل. قم بإزالة شظايا العظام عدة مرات باستخدام نظام الشفط.

بعد إزالة جزء العظم ، استخدم السائل الشوكي الاصطناعي أو محلول ACSF لإزالة وغسل أي حطام متبقي على سطح الدماغ. كرر إجراء التنظيف هذا عدة مرات لقمع ردود الفعل الالتهابية. باستخدام نظام حقن الضغط ، اضبط الضغط المناسب لحقن 500 نانولتر من محلول AAV من خلال شعيرات زجاجية بقطر طرف من 10 إلى 20 ميكرومتر لمدة 10 دقائق.

إذا انخفض مستوى محلول AAV في الشعيرات الدموية الزجاجية تدريجيا ، يتم إعطاء محلول AAV للدماغ. اترك الشعيرات الدموية الزجاجية في مكانها لمدة 10 دقائق إضافية لمنع التدفق العكسي. كرر هذا ثلاث مرات لإدارة ما مجموعه 1.5 ميكرولتر من محلول AAV في الدماغ.

ضع أغاروز ذوبان منخفض بنسبة 2٪ على سطح دماغ S1 باستخدام ماصة دقيقة ، ثم ضع نافذة زجاجية فوق حج القحف بكأسين للغطاء. اضغط على غطاء الزجاج ضد الأغاروز بينما لا يزال سائلا. هذا يمنع تكوين فقاعات الهواء في الأغاروز.

ختم حواف نافذة الجمجمة مع الأسمنت الراتنج لاصق الأسنان. لمعايرة نظام التحفيز المجسم ، ضع سطح شريحة الفلورسنت الحمراء على مستوى العينة واضبط المجهر في وضع التصوير المباشر مع ضوء إثارة ضعيف. قم بتشغيل واجهة المستخدم الرسومية للمعايرة.

mfile ، تحقق من جزء المعلمات وانقر على زر حفظ. انقر فوق الزر Z Scan في جزء الخطوة الأولى إذا كان سيولد تلقائيا ثلاث نقاط عشوائية في 21 مستوى محوريا مختلفا على بعد ميكرومترين من كل مستوى. حرك شريط التمرير وتحقق من الصورة الحية.

ابحث عن المستوى المثالي حيث تظهر البقع الأصغر والأكثر سطوعا ، ثم انقر فوق الزر حفظ. سيؤدي هذا تلقائيا إلى إنشاء واجهة موجية كروية إزاحة للهولوغرام الرقمي. انقر فوق الزر Go في جزء الخطوة الثانية ثم انقر فوق ستة نقاط في المربع الأيسر.

تحقق من الصورة الحية. إذا كانت هناك ست نقاط فلورية مميزة ، فاكتب المحور x و Y في مربعات التحرير وانقر فوق الزر حفظ. سيؤدي ذلك تلقائيا إلى إنشاء معامل تحويل دقيق لتنسيق المعايرة بين نظام التحفيز المجسم والتصوير.

ثم ، انقر فوق ملف تفحص زر في جزء الخطوة الثالثة. سيولد 441 صورة ثلاثية الأبعاد رقمية لإجراء مسح بقعة واحدة عبر مجال الرؤية في 21 × 21 خطوة. تحقق من الصور أثناء تغيير الأنماط في مربع القائمة.

اضبط طاقة الليزر للحصول على صور موضعية ضمن النطاق الديناميكي لجهاز التصوير. ضع جهاز التصوير في وضع التسجيل وانقر فوق الزر تشغيل. بعد اكتمال المسرحية، انقر فوق إنشاء خريطة الوزن في جزء الخطوة الرابعة واختر صورة مكدسة.

ثم أغلق نافذة واجهة المستخدم الرسومية للمعايرة. سيقوم تلقائيا بإنشاء خريطة وزن للتعويض عن الكثافة غير المتوازنة في كل بقعة. ضع الماوس المحقون AAV بلوحة رأس تحت المجهر وقم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون باستخدام مجهر ثلاثي الأبعاد ووضع ليزر ياقوتي مقفل من التيتانيوم مضبوط على 920 نانومتر بهدف 25x.

افتح برنامج التصوير التجاري في وضع التصوير المباشر. اضبط جهد كاشف الصورة وقوة ليزر التصوير لتحسين سطوع الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP8f. التقاط صور للخلايا العصبية التي تعبر عن هذا البروتين.

لإلقاء الضوء على الخلايا العصبية المحددة بإضاءة ثلاثية الأبعاد ، قم بتشغيل SLMcontrol. م ملف البرنامج النصي. انقر فوق الصورة المرجعية واختر الصورة التي تم الحصول عليها.

ثم ، انقر فوق الزر "بقعة" لاختيار وحدات بكسل معينة على الخلايا العصبية في الصورة واضغط على زر Enter على لوحة المفاتيح لإنهائها. لاكتشاف النشاط العصبي بدقة زمنية عالية باستخدام مستشعر الصورة ، اضبط وقت التعرض ومنطقة التصوير والتجميع ، ثم قم بإجراء التقاط الصورة. بعد وضع الماوس تحت المجهر وإجراء تصوير ثنائي الفوتون ، افتح برنامج التصوير التجاري.

في وضع التصوير المباشر ، اضبط جهد كاشف الصورة وقوة ليزر التصوير لتحسين سطوع الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP-6m-p2A-ChRmine. التقط صورا للخلايا العصبية التي تعبر عن هذه البروتينات ثم أضيء الخلايا العصبية المحددة باتباع الإجراء الموضح سابقا. للتحقيق في الاتصال الوظيفي داخل الخلايا العصبية في الطبقتين الثانية والثالثة ، استخدم معدل الضوء المكاني لتوليد أنماط ثلاثية الأبعاد للتحفيز البصري الوراثي ودمجها مع تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون.

اضبط شدة ليزر التصوير على 920 نانومتر عند 10 إلى 20 ملي واط ومجال الرؤية إلى 256 ميكرومتر × 256 ميكرومتر يقاس على عمق 100 إلى 150 ميكرومتر من السطح القشري. اضبط وقت بقاء البكسل على 1.5 ميكروثانية لاثنين هرتز أو 100 نانوثانية ل 30 هرتز. استخدم كلا من اثنين هرتز و 30 هرتز كمعدل إطار تصوير لمعرفة ما إذا كان محفز ثلاثي الأبعاد واحد تسبب في استجابة الكالسيوم في الخلايا العصبية.

اضبط شدة ليزر التحفيز المجسم الذي يحفز خلية عصبية واحدة عند 10 ملي واط وهو ما يكفي للحث على النشاط العصبي. في الوقت نفسه ، تخيل استجابة حديد الكالسيوم عند 920 نانومتر مع 10 محفزات ثلاثية الأبعاد عند 1040 نانومتر وفواصل ثماني ثوان لمدة 50 مللي ثانية بعد فترة خط الأساس البالغة 10 ثوان. بعد ذلك ، أعد الماوس إلى قفص المنزل.

يتم عرض الصورة التمثيلية وآثار الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP8f في تصوير 100 هرتز مع التحفيز المجسم ومستشعر الصورة هنا. يوضح هذا التمثيل البياني الاستجابة العصبية للتحفيز المجسم عند كل قوة ليزر. يتم عرض آثار الكالسيوم 2 + التمثيلية أثناء التحفيز المجسم ل 10 خلايا عصبية مختلفة بمعدلات إطارات تصوير 2 هرتز و 30 هرتز هنا.

نفس اللون يشير إلى نفس الخلايا العصبية. يوضح هنا رسم تخطيطي يقيم الروابط الوظيفية بين الخلايا العصبية. عندما تحفز الخلية العصبية البرتقالية، تستجيب الخلايا العصبية الحمراء في الوقت نفسه، مشيرة إلى وجود اتصال وظيفي بين هذه الخلايا العصبية.

تظهر هنا صورة نموذجية للخلايا العصبية الحسية الجسدية الأولية التي تعبر عن GCaMP6m في النوع البري. تمثل هذه الصور الرسومية آثار الكالسيوم 2 + النموذجية أثناء التحفيز المجسم بمعدل إطارين للتصوير و 30 هرتز. يمكن الكشف عن الاستجابة العصبية للتحفيز المجسم بسرعتي تصوير اثنين هرتز و 30 هرتز.

هذه الخطوات مهمة للحد من حركة الدماغ واثنين ، والحصول على نتائج مستقرة. نعتقد أن هذا المجهر يمكن أن يحفز السلوك في كتابة الخلايا العصبية بأنماط محددة. باستخدام هذه التقنية ، أصبحنا الآن قادرين على تقييم ومعالجة نشاط الخلايا العصبية الفردية وتوصيف الطب النفسي العصبي بالتفصيل.