منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2

يمكن لعلم النانو أن يعزز بشكل فعال الاستجابة المناعية الخاصة بالمستضد بعد عرض المستضدات على سطح الميزة الرئيسية في منصة اللقاح هذه يمكن أن تحقق الخروج من البلاك والعرض. بمعنى آخر ، فإن النظام الأساسي قادر على عرض مجموعة متنوعة من المستضدات في يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الجسيمات النانوية البيولوجية الأخرى لعرض المحرك على ناقلات بحجم النانو. لإجراء تحويل القسطرة التجسسية cytolysin A ، ابدأ بإضافة خمسة ميكرولتر من محلول البلازما إلى 50 ميكرولتر من سلالة BL 21 المختصة.

ينفخ برفق ويترك ليبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. ضع المحلول لمدة 90 ثانية في حمام مائي عند 42 درجة مئوية ، ثم ضع المحلول المختلط على الثلج لمدة ثلاث دقائق. أضف 500 ميكرولتر من وسط لوريا بيرتاني إلى المعلق البكتيري وبعد خلط الثقافة بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بلوحة كل لوحة أجار لوريا بيرتاني التي تحتوي على الأمبيسلين والثقافة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لإنتاج OMV spycatcher ، ابدأ بعزل مستعمرة واحدة من اللوحة إلى 20 ملليلتر من وسط لوريا بيرتاني واستزراع بين عشية وضحاها بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضان المحلول البكتيري في وسط سعة 2 لتر واستزراعه بمعدل 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي.

أضف الأيزوبروبيل بيتا D-IPTG لجعل التركيز النهائي للمحلول البكتيري 0.5 مليمولار ثم استزرع بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية OMV spycatcher. ابدأ بدمج المحلول البكتيري.

قم بتصفية المادة الطافية بمرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتركيزها باستخدام عمود ألياف مجوف. قم بتصفية المركز من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بدمجه مركزيا عند 150،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين باستخدام فتيل فائق الوسط ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق هطول الأمطار باستخدام PBS ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لإجراء نقل RBD spytag ، ابدأ باختيار نظام تعبير حقيقي النواة مناسب وزراعة الخلايا طوال الليل بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بعد التعافي. أضف 20 ميكرولتر HEK 293F من محلول الخلية إلى عداد الخلايا الآلي. سجل عدد الخلايا ، واضبط التركيز على واحد في 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر.

ثم استزرع الخلايا بمعدل 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة سلزية لمدة أربع ساعات. قم بتصفية علامة تجسس RBD على البلازميد من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر وأضف 300 ميكروغرام من البلازميدات إلى وسط زراعة الخلية حتى يصبح الحجم النهائي 10 ملليلتر. يهز لمدة 10 ثوان.

تسخين جزيرة الأمير إدوارد إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي. امزج 0.7 ملليلتر من جزيرة الأمير إدوارد مع 9.3 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا ، ورجه بشكل متقطع لمدة 10 ثوان. أضف محلول البلازميد إلى محلول جزيرة الأمير إدوارد.

يهز الخليط بشكل متقطع لمدة 10 ثوان ، ويحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف الخليط إلى 280 ملليلترا من وسط زراعة الخلايا ، واستزرع عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. بعد ذلك ، قم بإجراء تنقية RBD spytag.

ابدأ بدمج الخلايا المركزية عند 6،000 مرة G عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية. املأ العمود بملليلتر من النيكل NTA agarose واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف إيميدازول إلى طافت الخلية لجعل التركيز النهائي 20 ملي مولار ، وقم بتحميل طافت الخلية.

أضف ثلاثة أحجام أعمدة من PBS تحتوي على 20 مليمولار من إيميدازول للغسيل ، واجمع جزء الغسيل. التدرج الليوت مع ثلاثة أحجام أعمدة من PBS تحتوي على تركيزات منخفضة إلى عالية من إيميدازول إيلوت مرتين لكل تركيز. لتحديد تركيز البروتين بطريقة BCA ، قم بتخفيف محلول بروتين BSA القياسي بشكل متسلسل من 2 إلى 0.0625 ملليغرام لكل ملليلتر ، وقم بتخفيف مصيدة التجسس OMV المنقاة وعلامة تجسس RBD 10 مرات.

ثم امزج حلول عمل BCA A و B بنسبة 50 إلى واحد. أضف محلول البروتين المخفف ، واخلطه مع محلول عمل BCA. احتضان في 37 درجة لمدة 30 دقيقة.

قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر من كل بئر ، واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي. لأداء الاقتران الحيوي ل OMV spycatcher وعلامة تجسس RBD ، امزج OMV spycatcher و RBD spytag و PBS بنسبة 40 إلى واحد. قم بتدويره عموديا لخلط الخليط طوال الليل بمعدل 15 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بإجراء تنقية OMV RBD باستخدام حل PBS باستخدام إجراء مشابه لتنقية OMV spycatcher. يظهر مخطط تصميم البلازما أن جين spycatcher مرتبط بالجين cly A عبر رابط مرن بينما يتصل spytag بالطرف الرئيسي الخمسة لجين RBD مع جين hys tag للتنقية والتحقق. بعد الطرد المركزي الفائق ، بقيت جميع علامات التجسس RBD غير المتفاعلة تقريبا في المادة الطافية.

لم يوفر الطرد المركزي الفائق الثاني ميزة كبيرة أخرى على المرة الأولى. كان متوسط القطر الهيدروديناميكي z ل OMV spycatcher 133 نانومتر بينما كان 152.6 نانومتر ل OMV-RBD. قد تكون هذه الاختلافات بسبب RBD يزيد من حجم جسيمات OMV بعد العرض المكثف.

تتوافق نتائج TEM مع توزيع حجم الجسيمات الذي تم الحصول عليه من نتائج DLS. دوران لمزج الخليط مهم جدا. يمكن أن تكون كفاءة التفاعل أقل بكثير بدون دوران.