التحليل الآلي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا باستخدام ImageJ
أغسطس 9, 2022
تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية في كل من الفجوات العصارية الخاصة بالسالمونيلا والحرة في السيتوسول (فرط التكاثر). يتم وصف بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية هنا لتحديد الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا من خلال تحليلين متكاملين للصور من خلال ImageJ ، للوصول إلى دقة الخلية الواحدة والتسجيل.
تحدد طريقة الفحص المجهري الفلوري هذه الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية المعوية بطريقة آلية ، مما يسمح بدراسة السالمونيلا على أعداد كبيرة من السلالات بدقة قابلة للتطوير. تتميز طريقتنا بكونها كمية وعالية الإنتاجية وآلية في نفس الوقت ، وتعتمد على كل من تحليل المنطقة والخلية الواحدة. يعد السلوك داخل الخلايا أمرا أساسيا للتفاعل بين المضيف ومسبب المرض للعديد من البكتيريا.
يمكن تكييف طريقتنا بسهولة مع مسببات الأمراض البكتيرية بخلاف السالمونيلا ، مما يساهم في فهم التسبب في المرض. بعد الحصول على الصور ، قم بإجراء تحليل خلية واحدة عن طريق فتح عملية الاستحواذ. czi في ImageJ.
قم بتقسيم القنوات بالنقر فوق الصورة وتحديد اللون ، متبوعا بتقسيم القنوات. لتجزئة الخلية ، اختر صورة المستوى Z في نافذة عنوان الحصول على C1. حدد نافذة عنوان الاستحواذ C1 وانقر على الصورة متبوعة بالتكرار.
ثم اكتب رقم الطائرة Z المختارة. اكتب C1Zplane في مربع العنوان ، وقم بإلغاء تحديد مكدس مكرر، وانقر فوق "موافق" لتكرار صورة مستوى Z المحددة فقط. سيتم فتح نافذة تسمى C1Zplane تعرض صورة مستوى Z المحددة.
الآن قم بتحسين تباين الصورة لصورة C1Zplane التي تم الحصول عليها عن طريق تحديد عملية والنقر فوق تحسين التباين. اضبط وحدات البكسل المشبعة ، وحدد تطبيع ، وانقر فوق موافق لتطبيق تقنية تحسين التباين للحصول على صورة C1Zplane ذات تباين طبيعي. انتقل إلى العملية وانقر فوق Find Maxima لتقسيم الخلايا الظهارية في صورة C1Zplane ذات التباين الطبيعي.
بعد ذلك ، لإسناد نقطة قصوى واحدة فقط إلى كل خلية ظهارية ، ضع علامة على تحديد نقطة المعاينة وقم بتعيين تحمل التشويش. للحصول على صورة C1Zplane المجزأة، صورة ثنائية جديدة تشبه القناع تعرض كل جسيم مجزأ لكل نقطة قصوى محددة، ضع علامة على استبعاد الحد الأقصى للحواف، وحدد الجسيمات المجزأة كنوع مخرجات، وانقر موافق. بعد ذلك ، قم بإنشاء قناع للخلايا المجزأة في الصورة المجزأة C1Zplane. انقر على تحليل، متبوعا بتحليل الجسيمات، ثم حدد الخيارين إظهار الأقنعة والاستبعاد على الحواف.
اضبط الفاصل الزمني للحجم وانقر فوق موافق للحصول على قناع القناع الثنائي المجزأ C1Zplane. انقر فوق جدول البحث وحدد عكس جدول البحث في شريط الأدوات. لعتبة صورة C1Zplane التي تمت تسويتها بالتباين، انتقل إلى الصورة، وحدد ضبط، وحدد العتبة، وتحقق من الخلفية الداكنة.
اضبط إعداد العتبة التلقائية على الوضع الافتراضي واختر الخيار الأحمر. اضبط الحد الأدنى لقيمة القطع حتى تظهر الخلايا باللون الأحمر تماما ، تاركا خلفية داكنة. انقر Apply لتحويل صورة C1Zplane ذات التباين الطبيعي إلى صورة ثنائية مع خلايا باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود.
علاوة على ذلك ، لتصحيح تجزئة الخلية في قناع القناع الثنائي المجزأ C1Zplane ، حدد عملية وانقر على حاسبة الصور. بعد ذلك ، حدد قناع C1Zplane مجزأ كصورة واحدة ، واختر العملية AND في القائمة المنسدلة ، وحدد C1Zplane الذي تم تسويته بالتباين كصورة اثنين. انقر فوق "موافق" وسيقوم ImageJ تلقائيا بتسمية صورة الإخراج كنتائج لقناع C1Zplane مجزأ.
لتسمية كل خلية مجزأة من C1Zplane كمنطقة اهتمام ، انقر فوق تحليل ، متبوعا بتحليل الجسيمات. اضبط الحجم كما هو موضح سابقا وحدد خيار إظهار لا شيء. أضف جميع الجسيمات إلى أداة مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد إضافة إلى المدير.
أيضا ، تحقق من استبعاد على الحواف وانقر فوق موافق. احفظ بيانات عائد الاستثمار كعنوان اكتساب خلايا عائد الاستثمار. اضغط من خلال قائمة مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق المزيد وتحديد حفظ. بعد الانتهاء من تجزئة الخلية ، اعمل على نافذة عنوان الاستحواذ C2 لتحليل السالمونيلا الفراغية.
أولا ، انتقل إلى العملية ، وانقر فوق حاسبة الصور ، وحدد عنوان الاستحواذ C2 كصورة واحدة ، واختر العملية طرح في القائمة المنسدلة. ثم حدد عنوان الاستحواذ على C3 كصورة اثنين ، وتحقق من إنشاء نافذة جديدة، وانقر فوق موافق. قم بتطبيق الطرح على مكدس Z بالكامل بالنقر فوق نعم في نافذة مكدس العملية. كرر نتائج نافذة عنوان الاستحواذ على C2 بالنقر فوق قائمة الصورة وتحديد تكرار.
ثم تحقق من المكدس المكرر واضغط على موافق للحصول على نتائج نافذة واحدة لعنوان الاستحواذ C2. قم بتطبيق التمويه الغاوسي على نتائج عنوان C2 نافذة واحدة بالانتقال إلى العملية ، والنقر فوق تصفية ، وتحديد طمس Gaussian. اترك قيمة Sigma كاثنين أو قم بتخصيصها.
انقر فوق "موافق" وقم بتطبيق طمس Gaussian على مكدس Z بالكامل بالنقر فوق نعم في نافذة مكدس العملية. اطرح النتائج الغاوسية المصفاة لعنوان الاستحواذ C2 الأول إلى نتائج عنوان الاستحواذ C2 بالنقر فوق العملية وتحديد حاسبة الصور. الآن حدد نتائج عنوان الاستحواذ C2 كصورة واحدة ، واختر العملية طرح في القائمة المنسدلة ، وحدد نتائج عنوان الاستحواذ C2 الأول كصورة اثنين ، وانقر فوق موافق. قم بتطبيق الطرح على مكدس Z بالكامل بالنقر فوق نعم في نافذة Process Stack للحصول على نافذة يتم تسميتها تلقائيا بواسطة ImageJ كنتائج لنتائج عنوان اكتساب C2.
لفصل السالمونيلا عن خلفية نتائج نتائج عنوان اكتساب C2 ، انقر فوق الصورة ، وحدد ضبط ، وانقر فوق العتبة. بعد ذلك ، تحقق من الخلفية المظلمة واضبط العتبة التلقائية على Otsu. اضبط الحد الأدنى لقيمة القطع حتى تظهر السالمونيلا حمراء تماما ، تاركة خلفية داكنة.
انقر فوق تطبيق وستفتح نافذة باسم تحويل إلى ثنائي. تحقق من الخلفية السوداء وانقر فوق موافق. حدد المستوى Z الأوسط المقابل لمستوى تركيز السالمونيلا داخل الخلايا في نتائج النافذة الثنائية لعنوان اكتساب C2. انقر فوق الصورة متبوعة ب Stacks ثم حدد تعيين شريحة.
الآن اكتب رقم المستوى Z المفضل وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، قم بتعيين القياسات للتسجيل لكل عائد استثمار بالنقر فوق تحليل وتحديد تعيين القياس. بعد ذلك ، تحقق من المنطقة المقابلة للمساحة الإجمالية لكل عائد استثمار. لتسجيل جزء المساحة الذي تشغله وحدات البكسل العتبة لكل عائد استثمار ، تحقق من كسر المنطقة والحد إلى العتبة.
تحقق من تسمية العرض لتسمية كل عائد استثمار فردي بعنوان الصورة والقناة ومستوى Z وإحداثيات X / Y. استخدم المستوى Z المختار للسالمونيلا داخل الخلايا لتسجيل الملصقات والمساحة والنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا لكل خلية على حدة. افتح عنوان اكتساب خلايا عائد الاستثمار.
zip بالنقر فوق القائمة ملف وتحديد فتح. ثم ، انقر فوق قياس في قائمة مدير عائد الاستثمار. الإخراج عبارة عن جدول يبلغ عن القياسات المحددة.
أخيرا ، احفظ جدول النتائج عن طريق تحديد الملف والنقر فوق حفظ باسم في نافذة النتائج. تم تصور الغزو الخلوي ، والحمل الفراغي ، والتكاثر المفرط للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية. كشف تحليل المنطقة عن نسبة إصابة أعلى بكثير في السالمونيلا التيفية مقارنة بسلالات ديربي السالمونيلا ، مما يدل على فعالية تحليل المنطقة في الكشف عن الاختلافات في قدرة سلالات السالمونيلا على استعمار الخلايا الظهارية.
أظهرت سلالة السالمونيلا ديربي المتحولة المحذوفة sipA نسبة تكاثر مفرطة منخفضة مقارنة بالسالمونيلا ديربي من النوع البري ، بما يتفق مع دور sipA في إحداث فرط التكاثر. لم يلاحظ أي فرق في التكرار المفرط بين السالمونيلا التيفية والسالمونيلا ديربي من النوع البري. أظهر تحليل الخلية الواحدة عدم وجود فرق كبير في النسبة المئوية للخلايا المصابة في سلالات السالمونيلا ديربي مقارنة بالسالمونيلا التيفيموريوم.
خلاف ذلك ، ولدت سلالات ديربي السالمونيلا حمولة فراغية أقل بكثير من السالمونيلا التيفيموريوم. لم يلاحظ أي فرق بين السالمونيلا التيفية والسالمونيلا ديربي من النوع البري ، بينما أظهر السالمونيلا ديربي sipA انخفاضا كبيرا في التكاثر المفرط ، بما يتفق مع نتيجة تحليل المنطقة. السالمونيلا يشمل العديد من المصل مع ضراوة متنوعة.
يساهم فحص أعداد كبيرة من السلالات بهذه الطريقة السريعة والآلية بشكل كبير في فهم إمكانات الفوعة الحقيقية لهذا العامل الممرض.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة ميكروسكوبية بالفلورسنت عالي الإنتاجية لتحديد كميات الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية المعوية. يسمح البروتوكول بتحليل آلي، مما يمكن دراسة سلالات متعددة مع دقة قابلة للتطوير.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- تفاعلات المُمْرِض-المُضيف
- التصوير الخلوي
الخلفية
- تغزو السالمونيلا الخلايا الظهارية المعوية، وتتكاثر في الفجائع والسيتوسول.
- فهم السلوك داخل الخلوي ضروري لدراسة تفاعلات المُمْرِض-المُضيف.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى الأتمتة والقابلية للتطوير.
- تعالج هذه الدراسة هذه الثغرات بمقاربة كمية.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة عالية الإنتاجية لتحديد كميات الأنماط الظاهرية للسالمونيلا.
- تسهيل تحليل أعداد كبيرة من السلالات البكتيرية.
- توفير بروتوكول قابل للتكيف مع مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى.
الطرق المستخدمة
- الميكروسكوبية بالفلورسنت للحصول على الصور.
- برنامج ImageJ لتحليل الخلية الواحدة والمنطقة.
- فصل الخلايا الظهارية وتحديد كميات السالمونيلا داخل الخلايا.
- المعالجة الآلية لمجموعات Z لتحليل شامل.
النتائج الرئيسية
- تحديد كميات ناجح للأنماط الظاهرية للسالمونيلا بدقة خلية واحدة.
- القابلية للتطوير المثبتة لتحليل سلالات متعددة.
- توفير طريقة قوية قابلة للتكيف مع الدراسات البكتيرية الأخرى.
- تعزيز الفهم للسلوك داخل الخلوي للسالمونيلا.
الاستنتاجات
- الطريقة المطورة كمية، عالية الإنتاجية، وآلية.
- تسهم بشكل كبير في دراسة التسبب البكتيري.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Automated quantification of intracellular Salmonella phenotypes using ImageJ enables scalable, high-throughput analysis of host-pathogen interactions in epithelial cells. This approach supports robust, quantitative assessment of bacterial replication modes, directly informing early discovery and target validation for anti-infective strategies. The method's adaptability and throughput facilitate portfolio-wide screening and mechanistic de-risking in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of Salmonella replication phenotypes within host cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing vacuolar versus cytosolic bacterial behavior.
- Facilitates comparative analysis across multiple strains for functional target validation.
- Provides data-driven insights for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, automated scoring of infection phenotypes suitable for screening campaigns.
- Standardizes image analysis workflows, improving reproducibility and assay scalability.
- Generates quantitative outputs for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Enables batch processing and platform reuse across diverse experimental sets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant intracellular infection models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale strain comparisons.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement decisions in anti-infective pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This automated image analysis protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and screening in infectious disease research.
- Discovery Biology: Quantifies intracellular bacterial load and replication mode, clarifying host-pathogen pathways.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible scoring of infection phenotypes for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides single-cell and population-level quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects in vitro phenotypes to disease-relevant infection models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other bacterial pathogens, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in infection models.
- Operational Value: Automates and standardizes image analysis, enhancing reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis using ImageJ.
- Needs access to automated imaging platforms and computational infrastructure for batch processing.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various bacterial pathogens and cell models with protocol optimization.
- Throughput and resolution may be limited by imaging hardware and sample preparation quality.
