نظام تحليل الخلايا الهجينة لتقييم التغيرات الهيكلية والمقلصة لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لتقييم مخاطر القلب قبل السريرية

يمكن أن تساعد الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بسلامة القلب والسمية قبل السريرية باستخدام بيانات حقيقية قائمة على الإنسان من أجل الانتقال الآمن للأدوية الجديدة المرشحة إلى المراحل السريرية. بدلا من استخدام مجموعة من التقنيات المختلفة في المختبر وفي الجسم الحي ، فإن الميزة الرئيسية لهذا النظام الهجين هي التقييم المتزامن لعضلة القلب البشرية المشتقة من iPC ، ومعلمات الفيزيولوجيا الكهربية والجدوى ، وتحليل خصائص الانقباض في ظل الظروف الفسيولوجية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لاكتشاف الأدوية لأنها تغطي التغيرات الفيزيولوجية الكهربية والهيكلية والانقباضية لخلايا عضلة القلب ونظام إنتاجية أعلى يسمح باختبار 69 بئرا في وقت واحد.

لبدء طلاء اللوحة ، اترك الجزء السفلي من لوحة الانكماش مغطى بواقي الغشاء المزود بشكل إضافي حتى القياس في وحدة الانقباض. لبذر خلايا عضلة القلب ، قم بإعداد محلول طلاء جل EHS المخفف عن طريق نقل 2.75 ملليلتر من محلول EHS الجاهز للاستخدام و 8.25 ملليلتر من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم في أنبوب طرد مركزي معقم. ثم خلط الحل.

قم بإزالة واقي الغشاء من لوحة الانكماش. انقل محلول الطلاء المحضر إلى خزان كاشف معقم في روبوت أتمتة المختبر. استخدم البرنامج ، وأضف 100 ميكرولتر باستخدام روبوت أتمتة المختبر وأضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل بئر.

ثم ضع الغطاء مرة أخرى على لوحة 96 بئر واحتضانها لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد إذابة الخلايا وعدها ، اضبط الخلايا في وسط الطلاء الموصى به وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للخلية ، مما ينتج عنه 11 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل 11 ملليلتر لبذر لوحة كاملة من 96 بئرا. استخدم البرنامج لإزالة 100 ميكرولتر لإزالة محلول جل EHS من الآبار باستخدام روبوت أتمتة المختبر.

بعد ذلك ، انقل 11 ملليلترا من معلق الخلية إلى خزان كاشف معقم يوضع في روبوت أتمتة المختبر ، وزرع الخلايا ب 100 ميكرولتر من المعلق لكل بئر. باستخدام البرنامج ، تضيف الخلايا 100 ميكرولتر. مباشرة بعد بذر الخلية ، انقل اللوحة المرنة المكونة من 96 بئرا إلى الحاضنة التي يتم التحكم فيها بالرطوبة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، واترك الخلايا تستقر طوال الليل.

قم بتسخين 22 ملليلتر من وسط صيانة خلايا عضلة القلب لإضافتها إلى كل لوحة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. بعد 18 إلى 24 ساعة من بذر الألواح ، انقل الوسط الطازج إلى خزان كاشف معقم واتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. ثم قم بإجراء إزالة متوسطة مع البرنامج ، وإزالة 100 ميكرولتر.

بعد ذلك ، ضع خزان الكاشف الذي يحتوي على الوسط الطازج في روبوت أتمتة المختبر وقم بتوزيع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل بئر مع البرنامج ، أضف 100 ميكرولتر. نفذ هذه الخطوة مرتين للوصول إلى 200 ميكرولتر لكل بئر. مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة إلى الحاضنة.

قم بإجراء تبادل متوسط كل يوم حتى إضافة مركب. قبل أربع إلى ست ساعات من إضافة المركب ، قم بإجراء تغيير متوسط نهائي عن طريق نقل 22 ملليلترا من مخزن الفحص الطازج والدافئ إلى خزان كاشف معقم وتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة المرنة مرة أخرى إلى الحاضنة.

قبل ساعة واحدة من قياس خط الأساس ، انقل اللوحة إلى جهاز القياس المعني. في برنامج التحكم ، افتح بروتوكول التحرير وحدد وضع القياس أو الموقع المرن أو EFP المعاوقة. حدد مدة المسح أو طول قياس واحد إلى 30 ثانية وفاصل التكرار إلى 10 دقائق قبل حفظ رقم البروتوكول.

ثم حدد بدء البروتوكول واستمر في ملء الحقول المطلوبة. عند تعيين المعلمات، حدد بدء القياس. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاثة قياسات أساسية في فواصل زمنية مدتها خمس دقائق قبل وقت قصير من إضافة المركب.

قم بإزالة 50 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت من كل بئر دون إزالة لوحة 96 بئر المرنة من جهاز القياس ، تليها إضافة 50 ميكرولتر من محلول المركب المركز أربع مرات في كل بئر من اللوحة وفقا لخطة القياس. بعد إضافة المركب ، حدد إضافة علامة كاشف لتحديد تخطيط اللوحة المركبة وحجم المحلول المركب. ثم حدد متابعة القياس القياسي أو تابع سلسلة القياس وفقا للخطة التجريبية.

يظهر التحليل التمثيلي آثار مثبط الكيناز Erlotinib على انقباض خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC. عند أدنى تركيز ، تسبب Erlotinib في انخفاض غير ذي دلالة إحصائية في السعة ، بينما أظهرت تركيزات micromolar من Erlotinib تأثيرات سمية قلبية تعتمد على الوقت والجرعة. شوهدت بداية التأثير من 96 ساعة مع ميكرومولار واحد Erlotinib ، في حين أن العلاج ب 10 ميكرومولار Erlotinib أدى إلى انخفاض كبير بعد 24 ساعة من إضافة المركب.

بعد تطبيق 10 ميكرومولار Epirubicin ، توقفت الخلايا عن الضرب في غضون 24 ساعة. مع تطبيق Epirubicin ميكرومولار واحد ، تبع انخفاض حاد في السعة بعد 24 ساعة توقف كامل للنبض حتى 48 ساعة. عند 100 نانومولار ، لوحظ انخفاض يعتمد على الوقت في سعة النبض.

عند أدنى تركيز 10 نانومولار ، تذبذبت السعة بشكل مطرد ، مما يؤكد أن تأثير Epirubicin كان يعتمد فقط على الجرعة. العلاج مع دوكسوروبيسين ونيفيديبين لمدة 24 ساعة يقلل من صلاحية الخلية بطريقة تعتمد على التركيز والوقت. عند تطبيق تركيزات النيفيديبين المتزايدة ، تكشف تسجيلات الجهد الميداني على الخلايا عن تقصير يعتمد على التركيز في مدة الحقل الطبيعية.

كما أظهر تقييم نيفيديبين فيما يتعلق بانقباض القلب انخفاضا كبيرا في السعة المعتمدة على التركيز عند القياس الحاد بتركيزات 10 نانومولار و 13 نانومولار. من المهم أن تتذكر أن الخلايا حساسة بشكل عام للمعلمات البيئية مثل تغيرات درجة الحرارة ودرجة الحموضة بالإضافة إلى المحاكاة الميكانيكية المدعومة بشكل خاص على ألواح الانكماش.