النقل الفعال للحمض النووي الريبوزي المرسال المنسوخ في المختبر في الخلايا المستزرعة باستخدام جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية

جسيمات الببتيد بولوكسامين النانوية هي واحدة من أنظمة توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال الرئوية المحتملة. يصنع بروتوكولنا جسيمات الببتيد بولوكسامين النانوية ذات إنتاجية وكفاءة أعلى ، مما يسهل تطوير لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال المخاطي. المواد التي تتطلبها هذه التقنية منخفضة التكلفة ، ويمكن إكمال البروتوكول في وقت قصير.

تتمتع جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية بالقدرة على التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال بكفاءة. أظهرت جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية انتقالا ناجحا للحمض النووي الريبوزي المرسال في الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية، مما ينطوي على تطبيقات إضافية للقاحات كوفيد-19 المخاطية، وعلاج سرطانات الرئة، والعلاج الجيني للتليف الكيسي. أتوقع أن يكون لدى الفرد بعض المعرفة الأساسية في مجال ذي صلة ومع البروتوكول والكثير من التقنيات أيضا ، قبل أن يبدأ في إجراء التجارب.

بعد توليف إطار القراءة المفتوح ل Metridia luciferase واستنساخه في متجه pUC57 ، قم بإعداد قالب حمض نووي خطي باستخدام BamHI و KpnI عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإعداد تفاعل بحجم 20 ميكرولتر لتوليف الحمض النووي الريبوزي المرسال باستخدام مجموعة نسخ T7 والسودو أوريدين كما هو موضح في المخطوطة. تخلط المكونات جيدا وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

ثم ، قم بإزالة البنية الثانوية ل 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT غير المغطى عن طريق تسخينه عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استخدم نظام تغطية Cap 1 لسد الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، وقم بإعداد Cap 1 عن طريق تعديل بنية غطاء 7-methylguanosine باستخدام S-adenosylmethionine و 2'O-methyltransferases عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المغطى باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية.

باستخدام علامة الحمض النووي الريبي ، قم بتحليل الحجم الجزيئي ل IVT mRNA المغطى في هلام أغاروز 1٪ من الفورمالديهايد الذي يحتوي على 18٪ من الفورمالديهايد. تحضير 10 ملليغرام لكل ملليلتر محلول مخزون من البولوكسامين 704 عن طريق إذابة T704 في الماء الخالي من النوكليز. تحضير 2 ملليغرام لكل ملليلتر محلول مخزون من الببتيد عن طريق إذابة الببتيد في الماء الخالي من النوكليز.

تخزين الحل المحضر في 4 درجات مئوية. إذابة الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT على الجليد. قبل فتح الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة ثلاث ثوان في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخفيف محلول IVT mRNA بالماء الخالي من النوكليز.

قم بإعداد محلول مزيج الببتيد T704 والببتيد الاصطناعي عن طريق تخفيف محلول T704 إلى ثمانية ميكروغرام لكل تركيز ميكرولتر ، ومحلول الببتيد الاصطناعي إلى 0.555 ميكروغرام لكل تركيز ميكرولتر ، مع ماء خال من النوكليز ، على التوالي. احتضن المحلول المختلط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مرة أخرى. اسحب محلول IVT mRNA إلى حقنة سعة ملليلتر واحد ، وتجنب فجوات الهواء أو الفقاعات في طرف المحقنة.

قم بتحميل المحقنة في جانب واحد من الخرطوشة بجوار الكتلة الدوارة. ثم املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بمحلول مزيج الببتيد الاصطناعي T704 وقم بإزالة أي فقاعات أو فجوات هوائية عند طرف المحقنة. ضع المحقنة في المدخل الآخر للمضخة ، واضبط المضخة بمعدل تدفق إجمالي يتراوح من 4 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة.

ضع أنبوبا مخروطيا خاليا من RNase سعة 10 ملليلتر لجمع محلول mRNA / PP-sNp المختلط IVT في نهاية مسار تدفق جهاز الخلط. قم بتشغيل المضخة لبدء الخلط ، مما يضمن إدخال المعلمات بشكل صحيح. بعد تشغيل المضخة لمدة ست ثوان ، اجمع عينة IVT mRNA / PP-sNp من الأنبوب المخروطي.

صفيحة الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية وخط الخلايا المتغصنة في لوحات 96 بئر قبل 24 ساعة من النقل. تنمو الخلايا في وسط ثقافة مكمل بمصل بقري جنيني معطل حراريا بنسبة 10٪ و 1٪ ستربتومايسين البنسلين. بعد إزالة وسط النمو ، اغسل الخلايا المطلية ب 0.2 ملليلتر لكل بئر PBS.

أضف 170 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخالي من المصل إلى كل بئر يحتوي على مزارع الخلايا المطلية. ثم ، أضف 30 ميكرولتر من تركيبة IVT mRNA / PP-sNp التي تحتوي على 0.4 ميكروغرام من Metridia luciferase mRNA تسقط بحكمة في كل بئر. احتضن الخلايا بتركيبة IVT mRNA / PP-sNp في جو رطب غني بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

استنشق وسط النقل وأضف 0.2 ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة المكمل بمصل بقري جنيني معطل حراريا بنسبة 10٪ و 1٪ ستربتومايسين البنسلين. احتضان الخلايا المنقولة لمدة 24 ساعة كما هو موضح سابقا وجمع المواد الفائقة ليتم اكتشافها من كل بئر. قم بإعداد محلول فحص جديد عن طريق إضافة PBS إلى ركيزة coelenterazine.

امزج المحلول جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. أضف 50 ميكرولتر من السوبرناتانت التي تم جمعها إلى طبق من 96 بئرا. قم بإعداد قارئ microplate مع وقت قراءة يبلغ 1،000 مللي ثانية وإضافة 30 ميكرولتر من محلول coelenterazine إلى كل بئر يدويا أو عن طريق الحقن الآلي.

مباشرة بعد إضافة محلول coelenterazine إلى supernatant ، انقر فوق Start (ابدأ) لقياس إشارة التلألؤ. تم عزل البلازميد المؤتلف وهضمه لإنتاج قالب الحمض النووي الخطي. أنتج النسخ في المختبر mRNA MetLuc ومتوجا.

أظهرت الخلايا المنقولة باستخدام Metridia luciferase mRNA / PP-sNp تعبيرا أعلى بكثير عن luciferase مقارنة بتلك المنقولة باستخدام كاشف النقل القائم على الدهون المتاح تجاريا ، والببتيدات الاصطناعية Metridia luciferase mRNA أو PBS أو T7044 العارية ، والمحلول المختلط في الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية ، و 16 HBE ، وخط الخلايا المتغصنة DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp أظهر تعبير luciferase أعلى من LP.مما يشير إلى أن نظام توصيل PP-sNp مهم ل حماية الحمض النووي الريبوزي المرسال MetLuc من التدهور وتعزيز كفاءة نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) من Metridia luciferase الخارجي. يرجى التأكد من إزالة الهيكل الاصطناعي ل Met-mRNA غير المغطى بنجاح. قم بحساب وتنزيل مركب Met-mRNA T704 والببتيد بعناية لإعداد وضغط جسيمات البولوكسامين النانوية.

يمكن إجراء الفحص المجهري الإلكتروني الناقل لمراقبة مورفولوجيا جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تطوير لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال المخاطي وتمكين الفحص عالي الإنتاجية لتركيبات العلاج الجيني لكل خلية ذات صلة.