بناء الببتيدات الحلقية المخترقة للخلايا لتعزيز اختراق الحواجز البيولوجية

تتمثل إحدى العقبات الخطيرة أمام علاج السرطان في محدودية وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة بسبب الحواجز الفسيولوجية. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة قادرة على معالجة الحواجز البيولوجية أمر مرغوب فيه بشدة لتعزيز كفاءة توصيل الدواء. الغرض من هذا الإجراء هو توليف الببتيدات الحلقية المخترقة للخلايا لتعزيز الاختراق من خلية إلى خلية.

ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن تحقيق تدوير الببتيد بسهولة من خلال تفاعلات الاستبدال مع السيستين والراتنج دون الحاجة إلى أي محفزات معدنية. يؤدي دمج الروابط المتقاطعة العطرية إلى تحسين الكارهة للماء بشكل عام للببتيدات مقارنة بالوصلات المتقاطعة المحبة للماء أو التريازول ، وبالتالي تعزيز نفاذيتها. للبدء ، قم بتجميع جهاز تخليق الببتيد اليدوي في غطاء الدخان.

ضع المحبس ثلاثي الاتجاهات على مشعب الفراغ وقم بتوصيله بالنيتروجين. تأكد من تغطية المداخل غير المستخدمة. قم بتوصيل عمود بولي بروبيلين سعة 10 ملليلتر على محبس ثلاثي الاتجاهات واستنزاف خليط التفاعل أو المذيبات من عمود البولي بروبلين باستخدام لمبة ماصة مطاطية أو فراغ عبر مصيدة نفايات.

لتحضير الراتنج لتخليق الببتيد ، أضف 4 إلى 5 ملليلتر من DMF إلى الكمية المطلوبة من الراتنج وانقله إلى عمود البولي بروبلين مع فقاعات النيتروجين اللطيفة لمدة 30 دقيقة لتضخم الراتنج بشكل كاف. صفي DMF وأضيفي 4 إلى 5 ملليلتر من 50٪ مورفولين / DMF إلى الراتنج. ضع النيتروجين برفق لمدة 30 دقيقة لإزالة مجموعة Fmoc N-terminal ، ثم صفي الخليط.

اغسل الراتنج جيدا ثلاث مرات عن طريق إضافة 4 إلى 5 ملليلتر من DMF إلى العمود والفقاعات بالنيتروجين لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة. بنفس الطريقة ، اغسل الراتنج بثنائي كلورو الميثان ثلاث مرات و DMF ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإذابة 648.8 ملليغرام من الأرجينين المحمي من Fmoc و PBF و 372.6 ملليغرام من HATU في 5 ملليلتر من DMF في أنبوب طرد مركزي.

أضف 348.4 ميكرولترا من DIPEA لتنشيط تفاعل الاقتران ، وانقل خليط التفاعل إلى عمود البولي بروبلين مع الراتنج. حرك الخليط برفق مع فقاعات النيتروجين لمدة 1-2 ساعة ، ثم كرر تفاعل الاقتران مرة واحدة. صفي خليط التفاعل واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DMF و dichlorromethane و DMF مرة أخرى ثلاث مرات لكل منهما لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة.

قم بإزالة مجموعة حماية Fmoc واغسل الراتنج باتباع الإجراء الموضح سابقا قبل الشروع في إقران الحمض الأميني التالي. بعد ذلك ، قم بإقران بيتا ألانين كفاصل لوضع العلامات FITC باستخدام نفس العملية الموضحة لاقتران الأحماض الأمينية ، ثم أضف مزيجا من FITC و DIPEA و DMF إلى عمود البولي بروبلين في الظلام لأداء وضع علامات FITC على الببتيدات على الراتنج. سيستغرق رد الفعل حوالي 8 ساعات.

لأداء تدوير الببتيد الخطي ، أضف مزيجا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي الأيزوبروبيل سيلان ، وثنائي كلورو ميثان إلى عمود البولي بروبلين لمدة 2 دقيقة لإزالة مجموعة السيستين التي تحمي الترتيل بشكل انتقائي. صفي الخليط وكرر الإجراء حتى يصبح المحلول المصفر عديم اللون لإزالة مجموعة حماية التريتيل تماما. قم بإجراء عمليات غسل متسلسلة للراتنج باستخدام DMF وثنائي كلورو الميثان ثلاث مرات على الأقل وقم بإذابة 4 ، 4'bis-bromomethyl-biphenyl في DMF مع DIPEA.

أضف الحل إلى العمود وتفاعل لمدة 4 ساعات. اغسل الراتنج ب 4 إلى 5 ملليلتر من الميثانول مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما ، وجففه بتدفق مستمر من النيتروجين. بالنسبة للببتيدات التي تحتوي على السيستين ، عالج الراتنج بكوكتيل انشقاق فعال من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي أيزوبروبيل سيلان ، والماء أو حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي أيزوبروبيل سيلان ، 1 ، 2-إيثانديثيول ، والماء.

عالج الراتنج المرتبط بالببتيد لمدة 2 إلى 3 ساعات لشق الببتيد ، ثم قم بإزالة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بعناية باستخدام تيار من النيتروجين. للحصول على الببتيدات الخام ، أضف 4 إلى 5 ملليلتر من ثنائي إيثيل الأثير إلى تحضير الببتيد المشقوق لترسيب الببتيدات الخام ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10،000 × جم لمدة 4 دقائق. تخلص بعناية من المادة الطافية وجفف الببتيد في الهواء لمدة 3 دقائق في غطاء دخان فعال.

قم بإذابة الببتيد الخام صغير الحجم في 800 ميكرولتر من الأسيتونيتريل ، ثم قم بتحليله باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ذات طور عكسي وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة. تلقيح 100،000 خلية هيلا في 2 ملليلتر من DMEM في غرفة ذات 12 بئرا مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة ، واحتضانها لمدة 24 ساعة في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة الوسط واحتضان الخلايا في الغرف باستخدام 1 ملليلتر من 10 ميكرومولار FITC-R8 أو FITC-sR8-4 في DMEM الخالي من FBS لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الببتيدات وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف 1 ملليلتر من DMEM الطازج الخالي من FBS إلى الغرف ، ثم شارك في احتضان خلايا HeLa في الغرفة مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة ، مع خلايا HeLa على أغطية مستديرة في الأسفل لمدة 2 ساعة. ثبت خلايا HeLa على أغطية مستديرة بنسبة 2.5٪ جلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI لمدة 15 دقيقة.

أخيرا ، راقب خلايا HeLa الموجودة على أغطية الغلاف تحت مجهر مضان. يتم تقديم رسم تخطيطي لتوليف الببتيد الخطي R8 المسمى FITC والببتيد R8 المسمى FITC هنا. يظهر في هذا الشكل أطياف HPLC و MS للببتيد الخطي R8 والببتيد R8 المدبس.

كان وقت الاحتفاظ بالببتيد المدبس أطول بكثير من وقت التناظرية الخطية ، مما يشير إلى تعزيز الكارهة للماء بشكل عام للببتيد بعد الدوران باستخدام الوصلة المتقاطعة الكارهة للماء. تمثل هذه الصورة الرسومية استقرار الببتيد الخطي والببتيد المدبس في وجود 25٪ FBS. يظل R8 الدوري سليما بنسبة 77.3٪ بعد الحضانة مع FBS لمدة 4 ساعات ، في حين أن نظيره الخطي قد تدهور في الغالب ، مما يشير إلى تعزيز الاستقرار المحلل للبروتين للببتيد R8 الدوري.

يتم عرض صور مجهرية مضان الخلية الحية لخلايا HeLa وخلايا 4T1 بعد حضانة لمدة ساعة واحدة مع 3 ميكرومولار من الببتيد الخطي R8 المسمى FITC وببتيد R8 المسمى FITC. يمكن ملاحظة أن الخلايا المعالجة ب R8 الدوري مع الارتباط المتقاطع العطري أظهرت مضانا داخل الخلايا أعلى من تلك التي عولجت بنظيرتها الخطية. تم الحصول على نتائج مماثلة مع تحليل التدفق الخلوي.

لمزيد من التحقيق فيما إذا كان R8 الدوري يمنح اختراقا معززا من خلية إلى أخرى ، تم استخدام نماذج transwell لمحاكاة نفاذية حاجز الببتيدات من طبقة خلية إلى أخرى. أظهر R8 الدوري بوضوح تغلغلا أعلى عبر الحاجز من الببتيد الخطي R8 ، كما يتضح من الزيادة الكبيرة في التألق داخل الخلايا. يعد إزالة الحماية الكاملة لمجموعة trityl من السيستين والراتنج أمرا مهما لخطوة التدوير التالية.

إلى جانب ذلك ، تعتمد كفاءة التدوير أيضا على التسلسلات المحددة وأطوال الببتيدات بسبب التأثيرات الستيرية. في مثل هذه الحالة ، سيكون من المفيد استخدام راتنج ذو قدرة تحميل أقل أو تدوير الببتيدات تحت تركيزات مخففة في مرحلة المحلول. أظهرت هذه الببتيدات الحلقية نفاذية محسنة من خلية إلى خلية مقارنة بنظيراتها الخطية.

نعتقد أنها تحمل وعدا كبيرا للتغلب على الحواجز البيولوجية وسيتم استخدامها كجزيئي لمزيد من التطبيقات في مجال توصيل الأدوية.