الجمع بين مجهر المقاصة والتألق لتصور التغيرات في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية للبلازموديوفورا براسيكاي

يصف البروتوكول الحالي طريقة محسنة للمراقبة النسيجية للكرات التي تسببها Plasmodiophora brassicae. يتم مسح أقسام Vibratome من hypocotyls قبل التصوير الفلوري لدراسة تورط عوامل النسخ والهرمونات النباتية أثناء تطور المرض. يتغلب هذا البروتوكول على قيود تضمين الراتنج ، مما يتيح في تصور النبات للبروتينات الفلورية.

Plasmodiophora brassicae هو العامل الممرض الحيوي الإلزامي الذي ينتقل عن طريق التربة والذي يهاجم النباتات من عائلة Brassicaceae. عند الإصابة ، يؤدي العامل الممرض إلى تطور الكرات على الأجزاء تحت الأرض من النبات ، ومن هنا جاء اسم مرض clubroot. ويرافق تطوير الكرات إعادة برمجة معقدة للغاية.

لذلك ، فإن إمكانية تتبع التغيرات الداخلية أثناء المرض أمر بالغ الأهمية لفهم هذا التفاعل بين النبات ومسبب المرض. يعمل بروتوكولنا على تحسين تصوير الكرات المعقدة والسميكة والكرات. إنه يسهل تصور التغيرات في التعبير الجيني ، والاستجابات الفسيولوجية ، وتوازن الهرمونات النباتية ، وتطور المرض ، وتوزيع الأبواغ ، واللجنين المحلي.

يحافظ البروتوكول على البروتينات الفلورية داخل العينات ، مما يسمح بتخزين ومعالجة الأشياء على مدى فترة طويلة. كما أنه يتيح تتبع التغيرات البيوكيميائية والهيكلية المصاحبة لتطور المرض. سيوضح الإجراء سارة بليشارز ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مجموعتنا ، وديكشا سينغ ، طالبة دكتوراه من مختبرنا ، وكورنيل ميشالاك ، طالبة دكتوراه من مجموعة البروفيسور أغنيسكا باغنيوسكا-زادورنا في جامعة آدم ميكيفيتش.

ابدأ بإعداد الأنسجة النباتية. قم بإزالة التربة بعناية من أنظمة جذر النباتات المصابة وغير المصابة. نظف جيدا بالماء واجمع hypocotyls والكرات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.

ثبت العينات في 200 إلى 500 ميكرولتر من مثبت بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة عن طريق تطبيق فراغ ثابت من 700 مليبار باستخدام مضخة تفريغ. تأكد من أن الكائن مغمور تماما في محلول بارافورمالدهايد. استخدم 4٪ أغاروز لتضمين hypocotyls غير المصابة والكرات المصابة.

غلي المحلول لإذابة الأغاروز وصبه عندما يبرد بينما لا يزال لزجا. جفف الجسم قليلا على منديل لبضع ثوان لإزالة البارافورمالدهيد الزائد. استخدم المسواك أو الملقط لتضمين وتوجيه كائن النبات في الأغاروز بعناية.

لمنع المقاطع المائلة ، تأكد من توجيه الكائن وتشكيله بشكل صحيح بحيث يكون محوره عموديا على مستوى شفرة الاهتزاز. لتسريع تصلب الأغاروز ، ضع صفيحة بتري أو متعددة الثقافات عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. باستخدام شفرة ، قم بقص الكائن وتشكيله بعناية داخل كتلة أغاروز ، مع ملاحظة الاتجاه المفضل للتقسيم.

قم بلصق كتلة الأغاروز أو المرارة الكبيرة لتركيبها بشكل صحيح على حامل العينة باستخدام cyanoacrylate أو الغراء الفوري وشريط التقنيع. اضبط سمك الأقسام والسرعة وسعة الاهتزاز وفقا لسمك المرارة وحجمها. أضف الماء المقطر إلى حمام الماء وابدأ بالتقسيم.

اجمع الأقسام بعناية باستخدام ملقط أو فرشاة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على ملليلتر واحد من 1X PBS المخزن المؤقت. قم بإزالة 1X PBS من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأضف 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول التطهير. استبدل محلول المقاصة بالحل الجديد إذا تغير لونه بعد مرور بعض الوقت أثناء معالجة العينة.

قم بإجراء تلطيخ أبيض كالكوفلور لجدران الخلايا للخلايا النباتية المتنفقة عن طريق تحضير 5٪ من صبغة الكالكوفلور البيضاء في محلول التطهير. ثم وصمة عار الخلايا في الظلام لمدة خمس دقائق على الأقل. صبغ الدهون باللون الأحمر النيلي واللجنين مع تلطيخ اللجنين Fuchsin الأساسي كما هو موضح في مخطوطة النص وقم بتركيب الأقسام التي تم تطهيرها على شريحة الفحص المجهري.

ثم راقب الخلايا تحت التألق أو المجهر متحد البؤر. استخدم أوضاع اكتساب متعددة لتصوير أكثر من طيف مضان واحد في وقت واحد. تم تتبع ديناميكيات المرض وتراكم مسببات الأمراض في الكرات المستعمرة بواسطة Plasmodiophora brassicae ، ولوحظ وجود خلايا كبيرة بها جراثيم P.brassicae بعد تلطيخ النيل الأحمر.

تم تصور التغيرات في تمايز نسيج الخشب عند الإصابة ب P.brassicae باستخدام تلطيخ Fuchsin الأساسي. تم استخدام نباتات Arabidopsis التي تحتوي على بنية pHCA2: erRFP لتصور التعبير الجيني HCA2 في أنسجة اللحاء داخل كرات clubroot. تمركز HCA2 مع اللحاء في المراحل المتأخرة من تطور المرارة المدفوعة ب P.brassicae ، وعكس النشاط الجيني الآلية التي يزيد بها P.brassicae من تعقيد اللحاء.

في 16 يوما بعد التلقيح ، تم تقييم استجابات السيتوكينين التفاضلية بين النباتات المصابة وغير المصابة عن طريق التحقق من تعبير علامة TCS: GFP في تطوير الكرات. يبدو أن استجابات السيتوكينين قد تضاءلت بشكل كبير في الكرات المصابة ، بينما ظلت قوية ، خاصة في تجمع اللحاء ، في النباتات غير المصابة. الخطوات الأكثر أهمية هي التثبيت في PFA والتضمين والتقسيم.

بالنسبة لتقسيم الاهتزاز ، يحتاج المرء إلى تحسين وضبط معلمات السرعة والسعة والسمك بعناية للحصول على أقسام عالية الجودة. مهدت تقنيات تقسيم الاهتزاز وإزالة الأنسجة الطريق لتعزيز التحليل المجهري للاستجابات الفسيولوجية أثناء تفاعلات الميكروبات النباتية والأنسجة التي تظهر نموا ثانويا مع تشريح خلوي معقد.