تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت

يمكن لهذه الطريقة التحقق من توجيه الحمض النووي الريبي في الأجنة ، أو اختبار أسئلة النمو المبكرة ، أو إنشاء فئران معدلة. يمكن استخدام أي تقدم في كريسبر كاس 9 مع هذه الطريقة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها سهلة التعلم وتستخدم الكواشف المتاحة للمختبرات التي يمكنها الوصول إلى الفئران.

في المستقبل ، ستكون هذه التقنية مفيدة لتصحيح مرض أو طفرة في نسل مصاحب أو مهم للزراعة. هذه الطريقة هي الأنسب لإنشاء نماذج الماوس. في مختبرنا ، كنا نستخدم أشكالا مختلفة من هذه الطريقة للتحقيق في الأحداث المحيطة بالإخصاب والتطور المبكر قبل الزرع ، وتحديدا تنظيم الجينات في قوة الجنين.

الجزء الأكثر تحديا هو استخدام الإبرة الزجاجية لنقل الأجنة من لوحة إلى أخرى. ستوضح هذا الإجراء شانتال ديالو ، أخصائية الأبحاث في مختبري. لبدء جمع الأجنة ومعالجتها ، ضع أنثى الفأر الرحيم على ظهره ورش 70٪ من الإيثانول على البطن ليتم فتحه جراحيا.

لفتح تجويف البطن وإزالة قنوات البيض ، قم بقطع طبقة الجلد بمقص جراحي وحدد موقع المبايض. بعد ذلك ، قم بإزالة كل من قنوات البيض جراحيا ، الموجودة بالقرب من المبايض ، وضعها في قطرات فردية سعة 50 ميكرولتر من M2 بالإضافة إلى وسط BSA. تحت مجهر ستيريو ، استخدم ملقط التشريح لشق أمبولة قناة البيض لتحرير مجمعات البويضات الركامية ، أو COCs ، التي تحتوي على البويضات ، ثم لتجنب ترحيل الحطام ، قم بنقل ودمج كل بويضة ركامية في قطرة واحدة سعة 50 ميكرولتر من M2 بالإضافة إلى BSA مع ماصة ذات مقبض مضبوط على 20 إلى 30 ميكرولتر.

بعد ذلك ، لإزالة الخلايا الركامية من الزيجوت ، انقل موانع الحمل الفموية مع القليل من الوسائط الإضافية إلى قطرة من 100 ميكرولتر M2 بالإضافة إلى الهيالورونيداز واخلطها برفق عن طريق السحب حتى يتم فصل الأجنة بشكل واضح عن الخلايا الركامية الأصغر بكثير. لتخفيف الهيالورونيداز وإزالة الخلايا الركامية السائبة ، استخدم ماصة تعمل بالفم لنقل الزيجوت إلى قطرة جديدة بسعة 50 ميكرولتر M2 بالإضافة إلى BSA. بعد ذلك ، لتآكل المنطقة الشفافة للجنين وتقليل العوائق المادية الإضافية لتسليم الكاشف ، انقل الأجنة إلى قطرة 100 ميكرولتر من حمض Tyrode ، أو محلول AT ، على لوحة 60 ملم.

راقب الزيجوت باستمرار تحت مجهر ستيريو حتى تتآكل 30٪ من المنطقة الشفافة ، ثم لتخفيف AT، مرر الأجنة من خلال أربع قطرات سعة 50 ميكرولتر من M2 plus BSA. بعد ذلك ، حدد العدد المناسب من الأجنة التي تمت معالجتها عن طريق عدها تحت المجهر الاستريو. تمييع BSA عن طريق تمرير الأجنة من خلال قطرتين من 50 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة.

بعد ذلك ، ماصة الفم 25 إلى 30 جنينا في قطرة 10 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة ، ثم استخدم ماصة محمولة لإضافة 10 ميكرولتر من البروتين النووي الريبي أو مركب RNP. تمييع الجلسرين اللزج من مجمع RNP وتجانس العينة عن طريق ماصة 10 مرات أو حتى الخليط لم يعد يظهر اللزوجة. بعد ذلك ، ماصة 20 ميكرولتر من خليط الجنين و RNP في كفيت كهربي 0.1 سم مع تجنب الفقاعات ، ثم لتوصيل كواشف التحرير إلى الزيجوت ، قم بكهرباء الأجنة باستخدام بروتوكول موجة مربعة من 30 فولت ، 4 إلى 6 نبضات بطول نبضة 3 مللي ثانية ، و 100 فترة نبضة.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من M2 plus BSA إلى الجزء العلوي من الكوفيت لطرد الأجنة من الكوفيت وماصة برفق هذا الخليط على طبق. لزراعة الأجنة ، انقل 20 إلى 30 زيجوتا إلى قطرة من KSOM بالإضافة إلى BSA في صفيحة زراعة متوازنة مسبقا وانقل الأجنة إلى القطرة. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع رطوبة 95٪.

في اليوم التالي ، انقل الأجنة المكونة من خليتين فقط إلى قطرة جديدة من خليط KSOM plus BSA وأعد اللوحة إلى الحاضنة. اترك أو تخلص من الأجنة الميتة أو غير المخصبة. قبل التنميط الجيني، اغسل أجنة الكيسة الأريمية التوتية بقطرتين من DPBS لتخفيف مكونات الوسائط التي قد تتداخل مع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

باستخدام ماصة الفم ، انقل الأجنة الفردية إلى بئر واحد من شريط PCR المكون من 8 آبار وأضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل. بعد ذلك ، لتحليل الأجنة ، قم ببرمجة دورة حرارية إلى 55 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، ثم قم بإلغاء تنشيط البروتين K مع حضانة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. في هذه الدراسة ، تم عرض مثال على استراتيجية لاستهداف موضع التيروزيناز الفأر كعنصر تحكم إيجابي ، بما في ذلك تصميمات oligo واستراتيجيات التنميط الجيني لربط النهاية غير المتماثل والإصلاح الموجه بالتماثل.

عند تقديم دليل واحد ، أو sgRNA ، كان تسليم RNPs يصل إلى 100٪ في سلالات الماوس الأسود C57 6J و C57 الأسود 6N مع تشكيل حذف الإدراج الذي يحدث عند 50 إلى 100٪ والبدائل الصغيرة القائمة على oligo تتراوح من 17 إلى 63٪عند هندسة عمليات الحذف الجينومية ، تختلف فعالية التحرير من 3٪ إلى 100٪يجب أن يبقى الجنين في أقرب وقت ممكن من الظروف المثالية حتى يكون أسرع يتم البروتوكول ، كان ذلك أفضل. أيضا ، قلل من التعرض للهيالورونيداز وحمض التيرود. تصف هذه الطريقة توليد محرر ، أو اختبار الزرع أو قابلية الحمل ، أو إجراء التجربة عدة مرات لجمع القياسات أو الصور والمقاييس المختلفة أثناء تطوير ما قبل الزراعة.