عزل براز الفئران وزرع الجراثيم

لقد وصفنا هنا بروتوكولا لتوجيه الآخرين في التحقيق في آليات dysbiosis في المرض ، من جمع عينات البراز إلى استخدام طريقة اللفة السويسرية لدراسة التغيرات في الأمعاء. للبدء ، قم برش الصدر وجوانب الفأر الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وافتح الجلد والتجويف البريتوني بعناية لفضح الجهاز الهضمي. اعزل الأعور ، واستخدم مقصا جراحيا معقما لقطعه إلى نصفين.

فضح الأعور لفترة وجيزة ، وقطع 0.5 سم بالقرب من الدقاق و 0.5 سم بعيدا عند تقاطعه مع القولون. انقل الأعور المعزول إلى طبق بتري معقم. استخدم ملعقة معقمة لنقل محتوى cecal إلى أنابيب معقمة ، وقم بتخزين القسامات في فريزر 80 درجة مئوية.

أعد تعليق الكريات البرازية الطازجة أو المجمدة سابقا في محلول ملحي معقم بنسبة 1 إلى 20 ، ودوامة حتى تصبح متجانسة. مرر التجانس من خلال مرشح نايلون ذو مسام 30 ميكرومتر لإزالة الجسيمات الكبيرة. أجهزة الطرد المركزي في 79G لمدة خمس دقائق ، وجمع طافي لاستخدامها في زرع.

التزويج الفموي 100 ميكرولتر من الملاط لكل فأر متلقي خال من الجراثيم لمدة ثلاثة أيام متتالية ، يليه التجويف كل ثلاثة أيام لمدة أسبوعين. ضع الماوس برفق في قيود على حامل الماوس المسخن مسبقا ، واترك الذيل بالخارج. قم بلصق الجزء العلوي بعناية دون الضغط عليه حتى لا تضغط على الماوس.

اترك الماوس يستريح في الحامل ، وضعه على منصة آلة الكفة الخلفية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ، مغطاة بورقة للتأقلم. اجمع ما لا يقل عن ثلاث جولات من قياسات الضغط الانقباضي باستخدام تخطيط التحجم بكفة الذيل ، وقم بحساب متوسط القياسات من جميع الجولات لمتوسط الضغط الانقباضي لكل. جمع محتويات cecal بشكل معقم من الفأر الرحيم.

لحصاد الأمعاء والأنسجة الأخرى ، حدد موقع الأنسجة في الماوس ، واستئصالها بالمقص لفحص دور ميكروبيوتا الأمعاء في صحة القلب والأوعية الدموية. في اليوم الأول ، تشريح أمعاء الفأر من الجانب الشرجي إلى جانب المعدة. ووضع كامل الجهاز الهضمي المعزول في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني.

اسحب الطرف القريب برفق من نهاية المعدة ، وقم بإزالة الدهون المحيطة والأنسجة الضامة باليد. عزل الأمعاء الدقيقة ، وجعل متعرج من النوع Z مع كل طول. ثم ، قطع للحصول على الاثني عشر ، الصائم ، والدقاقي.

عزل القولون عن طريق قطع قسم الأمعاء أسفل الأعور. قطع الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون. استخدم حقنة وإبرة بطرف كروي لغسل الأمعاء بعناية وغسلها بالداخل باستخدام برنامج تلفزيوني دون تمزيق الأمعاء.

ضع القناة الهضمية على ورق الترشيح ، وقم بتسمية الورقة باسم القسم ثم P في الزاوية اليسرى العليا للقريب أو D للبعيد في الزاوية اليسرى السفلية. قطع القناة الهضمية طوليا بمقص طرف الكرة. افتح القناة الهضمية على ورق الترشيح ، واغسلها بمزيد من برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.

ضع القناة الهضمية بين ورقتي ترشيح ، وقم بتدبيس أوراق الترشيح في أربع نقاط أو زوايا بالقرب من القناة الهضمية. انقع في محلول عازل محايد من الفورمالين بنسبة 10٪ ، ورجه باستخدام هزاز المنصة عند خمس دورات في الدقيقة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم الثاني ، سخني 2٪ أغاروز المحضر في الماء المقطر بقضيب تحريك في دورق مغطى بورق الألمنيوم.

لاسترداد الأنسجة ، قم بتجريد ورقة الترشيح العلوية ، ولف القناة الهضمية من الجانب القريب بحيث يذهب الجانب القريب إلى الداخل أولا ، ولف إلى الداخل بحيث يكون التجويف بالداخل على الشريحة أيضا. دبوس بإبرة قياس 30 أو اثنتين حسب الحاجة. نضح ملليلتر واحد من الأغاروز باستخدام ماصات نقل الخريجين التي تستخدم لمرة واحدة ، وصب الأغاروز على قسم الأمعاء المدلفن على سطح مستو مع تجنب فقاعات الهواء في الأنسجة.

بعد أن يبرد الأغاروز ويتصلب ، استخدم شفرة حلاقة لتقليم الأغاروز الإضافي حول قسم الأنسجة. أخيرا ، ضع أقسام الأمعاء في معالجة الأنسجة أو تضمين أشرطة ، وانقعها في 70٪ إيثانول عند أربع درجات مئوية. يظهر هنا تقدير التنوع البيولوجي للأنواع في محتوى cecal الذي تم الحصول عليه من الفئران على الوجبات الغذائية المالحة العادية والوجبات الغذائية عالية الملح.

تضمنت التغييرات في ميكروبيوتا الأمعاء استجابة لارتفاع الملح انخفاضا في التنوع البيولوجي البكتيري. يظهر القياس متعدد الأبعاد غير المتري أن البكتيريا من فئران الملح العادي وفئران النظام الغذائي عالي الملح تشكل مجموعات منفصلة. يرتبط الملح العالي بزيادة نسبة Firmicutes إلى Bacteroidetes.

إن زرع الجراثيم البرازية من الفئران التي تتغذى على نسبة عالية من الملح يهيئ الفئران الخالية من الجراثيم لارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II. ارتبط نقل ميكروبيوتا الأمعاء التي يسببها الملح العالي بزيادة الضغط الانقباضي بشكل ملحوظ في الفئران الخالية من الجراثيم مقارنة بالفئران التي تلقت ميكروبات الأمعاء المالحة الطبيعية. تظهر الصور التمثيلية بقعة صميم البروتين الشحمي A-I في الحرقفة التي تم الحصول عليها من الفئران التي كانت تعاني من فرط شحميات الدم بدون أو مع بيلة بروتينية.

يوائم هذا البروتوكول الخطوات الرامية إلى تحقيق نجاح FMT في الاعتبارات التجريبية الرئيسية لكل من المتبرعين من البشر والقوارض.