جمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في نموذج Teleost اليابانية Medaka (Oryzias latipes)
October 6th, 2022
توضح هذه المقالة طريقتين سريعتين وفعالتين لجمع الحيوانات المنوية من نموذج ميداكا الأسماك الصغيرة (Oryzias latipes) ، بالإضافة إلى بروتوكول لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA).
تتيح هذه التقنية أخذ عينات من الذوبان من سمكة نموذجية صغيرة ، Madaka اليابانية ، والتحقيق في جودتها بطريقة متسقة. على وجه التحديد جمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن يسمح بأخذ عينات متكررة على نفس الأسماك لأن هذا النهج ليس غازيا. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية لحفظ الحيوانات المنوية بالتبريد في ماداكا.
تعد جودة الحيوانات المنوية مؤشرا أساسيا لنجاح الإخصاب ، وبالتالي فهي معلمة مهمة يجب تحليلها في دراسات علم وظائف الأعضاء البيئية والإنتاجية الكاملة. للبدء ، قم بإعداد إسفنجة ناعمة ، عن طريق تقطيعها لتناسب متعجرف في طبق بتري. اقطع خطا مستقيما في منتصف الإسفنجة ، وهو طويل بما يكفي لتثبيت السمكة على جانبها البطني.
بعد تخدير الأسماك ، جفف بطن السمكة عن طريق مسحها برفق بمنشفة ورقية. ضع السمكة في حوض الإسفنجة الرطبة مع الجانب البطني لأعلى ، بحيث تتعرض خياشيمها لمحلول التخدير في الإسفنجة. إذا كانت المنطقة المحيطة بالعباءة مبللة ، جفف الجانب السفلي من البطن برفق بمسح منديل يمكن التخلص منه.
تحت مجهر تشريح ، ضع الماصة الدقيقة مع أنبوب شفاط متصل ضد عباءة السمكة. الآن قم بتدليك بطن السمكة عن طريق الضغط بلطف بملقط ناعم نهاية حادة في حركة منضدية إلى الذيلية. لاستعادة الأسماك ، حررها من الإسفنج إلى ماء الاسترداد المعد مسبقا قبل إعادة الأسماك إلى نظام الحوض.
انقل الذوبان الذي تم جمعه إلى أنبوب يحتوي على محلول تنشيط مسخن مسبقا ومحلول ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام مجموعة أنبوب الشفاط. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل. بعد القتل الرحيم ، جفف السمك كما هو موضح سابقا وضع السمكة تحت مجهر تشريح مع توجيه جانبها الجانبي الأيسر لأعلى.
باستخدام مقص تشريح صغير ، قم بقطع رفرف ظهريا من العباءة ثم عبر الأضلاع إلى الخياشيم لفضح الأعضاء الداخلية. حدد موقع الخصيتين واقطع المرفق من كلا الطرفين بالملقط الناعم. قم بإزالة الخصيتين ونقلهما إلى أنبوب معد يحتوي على محلول تنشيط مسخن مسبقا.
استخدم الملقط لسحق الخصيتين عدة مرات على جانب الأنبوب لتحرير الحيوانات المنوية ، والتي يمكن تصورها من خلال المظهر الغائم قليلا للمحلول. لبدء التحليل ، افتح برنامج تحليل الحيوانات المنوية وحدد وحدة الحركة. قم بتعيين التكوينات في البرنامج لجميع المعلمات.
ضع شريحة غرفة عد 20 ميكرومتر يمكن تسخينها مسبقا تحت المجهر على مرحلة ساخنة ، مضبوطة على 27 درجة مئوية. ماصة العينة في الحجرة على الشريحة حتى تمتلئ ، ولكن دون ملء زائد. امسح بعناية العينات الزائدة من مدخل الغرفة لمنع حركة الانجراف للخلايا في المحلول.
حدد تحليل لإلقاء نظرة على العينة تحت المجهر. تأكد من تركيز المجهر وحدد التحليل مرة أخرى لتسجيل الحيوانات المنوية في الحقل. انقل الشريحة إلى منطقة جديدة من العينة في الإطار وكرر الإجراء لثلاثة إلى خمسة مجالات رؤية مختلفة ، وتجنب فقاعات الهواء أو كتل الخلايا أو القطع الأثرية.
لعرض النتائج ، حدد النتائج ، وانقر نقرا مزدوجا فوق حقل لتصور الحقل الفردي أو للتحقق يدويا من أي منوية تم تسميتها بشكل خاطئ أو غير متعقبة. إذا لزم الأمر ، انقر بزر الماوس الأيمن على الحيوانات المنوية الفردية لإعادة تسمية الحركة. في هذه الدراسة ، تم استخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر لتسجيل مختلف معلمات السرعة والحركة.
تتضمن القيم المحسوبة مؤشر الاستقامة ومؤشر الخطية والتذبذب. أثرت تناضحية محاليل التنشيط على حركة الحيوانات المنوية من تشريح الخصيتين. كانت الحيوانات المنوية غير متحركة في ماء الحوض ، ولكنها متحركة في HBSS ذات أسمولية عالية ومنخفضة.
ومع ذلك ، يتم تقليل الحركة بشكل كبير عند 36 مللي أوسمول لكل كيلوغرام ، مقارنة بالمحاليل الأسمولية الأعلى. تأثرت الحركة أيضا بطريقة جمع الحيوانات المنوية ، حيث تكون الحيوانات المنوية أكثر حركة بشكل ملحوظ في طريقة تشريح الخصية مقارنة بتدليك البطن. أيضا ، كانت نسبة أعلى من الخلايا تقدمية والمزيد من الخلايا كانت إما متوسطة أو سريعة الحركة.
النسبة المئوية للحركة والتقدمية أعلى بكثير في الحيوانات المنوية المخزنة عند أربع درجات مئوية أو على الجليد ، مقارنة بتخزين 27 درجة مئوية. كما أثرت الظروف البيئية والسكنية بشكل طفيف على حركة الحيوانات المنوية. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في حركة الحيوانات المنوية في الحيوانات المنوية التي تم جمعها بعد وقبل التفريخ.
أظهر الذكور الذين تم إيواؤهم بدون إناث لمدة شهر حركة عالية ، لكن الفرق كان ضئيلا. لجمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن ، هناك حاجة إلى التدريب لتعلم ضغط وحركة الملقط المناسبة وتجنب التلوث الزائد. ستكون هذه التقنية مفيدة جدا للتحقيق على سبيل المثال ، في آثار الملوثات المتنوعة على خصوبة الذكور في دراسات السمية البيئية ، حيث يعد Medaka نموذجا شائع الاستخدام.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنيتين فعالتين لجمع الحيوانات المنوية من الأنواع النموذجية للأسماك الصغيرة، الميداكة (Oryzias latipes). تركز الطرق التي تمت مناقشتها على التدليك البطني وتحرير الخصيتين، إلى جانب بروتوكول لتقييم جودة الحيوانات المنوية باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الحاسوب (CASA).
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- علم الأحياء التناسلي
- علم السموم البيئية
- فيزيولوجيا الأسماك
الخلفية
- الميداكة هي كائن حي نموذجي مستخدم بشكل شائع في دراسات الخصوبة.
- جودة الحيوانات المنوية ضرورية للإخصاب الناجح.
- الطرق غير الغازية ضرورية لأخذ عينات متكررة.
الطرق المستخدمة
- جمع الحيوانات المنوية عبر التدليك البطني وتحرير الخصيتين
- الكائن الحي النموذجي: الميداكة (Oryzias latipes)
- تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الحاسوب (CASA)
النتائج الرئيسية
- تختلف حركة الحيوانات المنوية بشكل كبير مع طريقة الجمع المستخدمة.
- تؤثر الظروف البيئية على جودة الحيوانات المنوية، على الرغم من أن بعض العوامل لم يكن لها تأثيرات كبيرة.
- تم تحقيق مستويات عالية من الحركة من خلال تحرير الخصيتين مقارنة بالتدليك البطني.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة طرقًا موثوقة لجمع الحيوانات المنوية وتقييم جودتها في الميداكة.
- يمكن لهذه التقنيات أن تتقدم بالبحث في تأثيرات الملوثات على خصوبة الذكور.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sperm quality in Japanese medaka enables objective evaluation of male fertility, supporting mechanistic studies in reproductive biology and ecotoxicology. Computer-assisted sperm analysis (CASA) provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in vertebrate fertility research. These capabilities facilitate predictive confidence and risk-adjusted decision-making in translational and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental, physiological, and genetic factors affecting male fertility.
- Supports functional validation of reproductive targets through objective sperm quality metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables impacting motility and progressivity.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven fertility studies.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protocols for sperm collection and analysis in small vertebrate models.
- Standardizes motility and progressivity measurements for assay reproducibility.
- Enables scalable, repeatable workflows for compound or environmental screening.
- Supports reliable evaluation of toxicological or pharmacological impacts on reproductive endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sperm quality metrics with disease-relevant and environmental exposure models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of reproductive toxicity or efficacy.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate interventions or environmental assessments.
- Strengthens predictive value for cross-species translational research in vertebrate fertility.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized sperm quality assessment in small fish models, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Objectively quantifies sperm motility, progressivity, and concentration to clarify reproductive pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating environmental or compound effects on fertility.
- Analytics: Generates velocity, linearity, and motility indices for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges environmental, physiological, and genetic studies to preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for fertility assessment in diverse small vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of sperm analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in fertility and ecotoxicology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and environmental research programs.
Implementation Considerations
- Requires training in non-invasive and dissection-based sperm collection techniques.
- Needs access to computer-assisted sperm analysis instrumentation and software.
- Demands cross-team standardization of sample handling and analysis parameters.
- Adaptable to other small teleost or vertebrate models with protocol optimization.
- Careful technique is necessary to avoid sample contamination and ensure data integrity.
