نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء في المختبر

يمكن استخدام نظام الطبقة الثنائية الدهني المدعوم بشريط نانوي لدراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم ديناميكيات وتوزيع البروتين والدهون أثناء أنشطة الخلية. توفر هذه التقنية كلا من الجذر الفرعي العالي والسيئ في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على أخطاء نانوية براءات الاختراع مع انحناء الغشاء المحدد مسبقا بواسطة التصنيع النانوي عالي الدقة. للبدء ، ضع شريحة النانو في دورق سعة 10 ملليلتر بحيث يكون جانب النمط متجها لأعلى.

أضف بعناية ملليلتر واحد من 98٪ من حمض الكبريتيك إلى الدورق وتأكد من أن الحمض يغطي الجانب الأمامي والخلفي من الرقاقة بالكامل. قم بتدوير الكأس الزجاجية ببطء وأضف 200 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين قطرة قطرة حتى تصبح الكأس الزجاجية بأكملها ساخنة. تأكد من خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين جيدا لتشكيل محلول سمكة البيرانا لإزالة الجزيئات العضوية من رقاقة النانو.

ضع الدورق في وعاء زجاجي ثانوي واحتفظ بشريحة النانو مغمورة في محلول سمكة البيرانا طوال الليل لتنظيف الشوائب جيدا. أخرج الدورق واسحب محلول سمكة البيرانا بعناية في حاوية نفايات حمضية. حمل خمسة ملليلترات من الماء منزوع الأيونات في الكأس الزجاجية لتخفيف الحمض المتبقي وتخلص منه في الفضلات الحمضية.

كرر هذه الخطوة خمس مرات. أمسك الرقاقة بالملاقط واغسلها بتيار مستمر من الماء منزوع الأيونات لإزالة الحمض المتبقي جيدا. جفف الرقاقة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪ لتشكيل SLB.

سونيك خليط الدهون لمدة 30 دقيقة. تجمد خليط الليبيدات في النيتروجين السائل لمدة 20 ثانية ثم تذوب عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين في حمام مائي. كرر دورات التجميد / الذوبان 30 مرة.

بعد ذلك ، يبدو خليط الدهون كسائل صاف. مرر خليط الدهون عبر الطارد الصغير وبثق ذهابا وإيابا 20 مرة. اجمع سيارات الدفع الرباعي من المحقنة الموجودة على الجانب الآخر لتقليل التلوث بجزيئات أكبر أو مواد غريبة ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.

أخرج شريحة النانو النظيفة من الماء منزوع الأيونات بعناية باستخدام زوج من الملقط وجففها بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪. قم بإجراء التنظيف السطحي لرقاقة النانو باستخدام معالجة بلازما الهواء لمدة ساعة واحدة. قم بتجميع شريحة النانو في غرفة PDMS.

ابدأ بوضع الشريحة على سطح نظيف مع توجيه النمط لأعلى. قم بتغطية PDMS الأوسط برفق باستخدام الشريحة وتأكد من تعرض النمط بالكامل للمنطقة المركزية للفتحة الكبيرة ذات الشكل البيضاوي في PDMS الأوسط. قم بتغطية PDMS العلوي ب PDMS الأوسط واحتفظ بفتحتيه الصغيرتين داخل منطقة الفتحة البيضاوية الكبيرة لنظام PDMS الأوسط.

ثم يتم تجميع غرفة PDMS. قم بتحميل سيارات الدفع الرباعي في قناة PDMS من أحد الفتحتين الصغيرتين في PDMS العلوي باستخدام ماصة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل SLB. قم بماصة برفق المخزن المؤقت PBS في قناة PDMS من جانب واحد من الفتحة الصغيرة وقم بإزالة النفايات باستخدام برعم قطني من الفتحة الأخرى لغسل سيارات الدفع الرباعي غير المقيدة.

ثم الحصول على SLB شكلت على رقاقة نانو. قم بإعداد الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام هدف زيت 100 ×. افتح برنامج Zen لتحديد قوة ليزر الإثارة التي يمكن أن تثير مضان الدهون والبروتين.

اختر وضع الاستحواذ. ثم انقر فوق الإعداد الذكي ، متبوعا ب Texas Red. اضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز لتحديد موقع قضبان النانو على الشريحة حتى تصبح حواف شريط النانو حادة أسفل قناة الدهون.

اضبط معلمات المسح للحصول على صورة تحكم لقناة الدهون قبل إضافة البروتين. قم بإجراء فحص FRAP عن طريق التبييض باستخدام طبقة ثنائية الدهون الفلورية على منطقة نانوية مفردة عشوائية. حدد خانتي الاختيار مناطق التجربة والتبييض.

ارسم مساحة دائرية قطرها خمسة ميكرومتر والتي يمكن أن تشمل القضيب النانوي بأكمله في المركز ، وأضفه إلى مناطق التجربة. معلمات التصوير الفاصل الزمني الإدخال. اختر السلاسل الزمنية.

ثم انقر على المدة. حدد 100 دورة وفاصل زمني يساوي ثانيتين. معلمات التبييض المدخلة.

حدد خانات الاختيار بالليزر التي تقوم بإجراء FRAP وقم بتغيير الطاقة إلى 100٪ انقر فوق بدء التجربة لتجربة FRAP. قم بتحميل محلول البروتين في قناة PDMS واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بربط البروتين على SLB. أعد تركيز القضبان النانوية واضبط معلمات المسح لالتقاط صور لكل من قنوات الدهون والبروتين للكشف عن استشعار انحناء البروتين.

حدد مناطق التجربة وقم بإجراء اختبار FRAP على كل من قنوات الدهون والبروتين ، وقم بإجراء تصوير TimeLapse لتوصيف حركة بروتين استشعار الانحناء. كلاهما يظهر تراكما متزايدا في نهاية القضبان النانوية الفردية المطلية ب SLB بعرض 300 نانومتر. هنا يحتوي SLB على 10٪ PS لتعزيز ربط البروتين كهربائيا.

كلا البروتينين لهما نسبة أعلى من نهاية إلى مركز الليبيدات، وهي نسبة واحدة تقريبا. عند مقارنة IDR FBP17 و F-Bar ، تشير نسبة الطرف الأعلى إلى المركز ل IDR FBP17 إلى استشعار انحناء أقوى من F-Bar. أظهرت البروتينات الثلاثة تراكما تفضيليا في مواقع الغشاء المنحني النانوي عندما انخفض الانحناء إلى أقل من 400 نانومتر في القطر.

من بين مجالات البروتين الثلاثة هذه ، يعطي IDR FBP17 أعلى شريط نانو وكثافة ، مما يشير إلى أقوى قدرة على استشعار الانحناء ، بينما يظهر F-Bar أقل قيمة. يمكن رسم منحنى ربط البروتين عن طريق زيادة تركيز البروتين تدريجيا مما يدل على أن IDR FBP17 لديه قدرة قوية على استشعار الانحناء التعاوني. بالمقارنة مع الاسترداد السريع للإشارات الدهنية على القضبان النانوية ، لا يمكن ل F-Bar التعافي في غضون دقيقتين ، مما يشير إلى انخفاض كبير في حركة الغشاء وديناميكية الارتباط في مواقع الغشاء المنحني.

والمثير للدهشة ، تختلف إشارات IDR FBP17 عن سلوك F-Bar ، فقد أظهرت انتعاشا واضحا في نفس الإطار الزمني ، مما يشير إلى الطبيعة الديناميكية ل IDR FBP17 المتراكمة في الأغشية المنحنية. ومع ذلك ، بعد غسل IDR FBP17 غير المنضم في المحلول ، لا يمكن ملاحظة نفس الاسترداد في قناة IDR FBP17 كما كان من قبل. جودة SLB مهمة جدا عند دراسة التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتين.

لذا فإن اختبار FRAP ضروري في تجربتنا للتحقق من صحة حركة الغشاء. سيساعد هذا النظام الباحثين على دراسة المعلمات المختلفة التي تؤثر على تفاعل البروتين مع الغشاء المنحني ، مثل مجالات استشعار الانحناء ، وتكوين الدهون بالإضافة إلى إجراء الدراسات الديناميكية على الغشاء المنحني مثل سلوكيات فصل الوجه.