القياس الكمي القائم على التدفق الخلوي وتحليل الخلايا البائية لعضلة القلب

تشير الأدبيات إلى بيانات متناقضة حول انتشار الخلايا البائية لعضلة القلب. من المحتمل أن ينبع هذا من التباين في تقنيات التروية والهضم. يمكن بروتوكولنا التحليل القائم على قياس التدفق الخلوي القابل للتكرار على الخلايا البائية لعضلة القلب.

تعمل هذه التقنية على زيادة عائد استرداد الخلايا البائية إلى أقصى حد وتقليل التباين في عدد قياس التدفق الخلوي بين الخلايا البائية والمجموعات السكانية الأخرى من عينات القلب. يمكن تعديل طريقة الهضم والعزل المحسنة هذه بسهولة لتنفيذ لوحة موسعة للأجسام المضادة لدراسة أنواع الخلايا المناعية المختلفة في القلب. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على أعضاء أخرى ، مثل الرئة أو الكبد ، لدراسة الخلايا البائية المرتبطة بتلك الأعضاء.

للبدء ، تزن فأرا ذكرا يبلغ من العمر 12 أسبوعا. قم بتحميل حقنة الأنسولين 310 سم مكعب مع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة B220. حقن الجسم المضاد B220 المخفف عن طريق الحقن المداري الرجعي والمضي قدما على الفور في حصاد الأعضاء والتروية.

بعد القتل الرحيم ، أمسك جلد الفأر بالملقط في منطقة شرسوفي. قم بعمل فتحة بطول 2 ملليمتر في الجلد باستخدام المقص واستخدم الملقط لتقشير الجلد بعيدا للكشف عن طبقة اللفافة. قطع في الشرسوفي من خلال اللفافة والبريتوني.

المشبك عملية الخنجري باستخدام ملقط مرقئ. قم بعمل قطع عمودي من خلال جدار الصدر على مستوى خط منتصف الترقوة على كل جانب وارفع جدار الصدر الأمامي للكشف عن محتوى المنصف. أمسك الشريان الأورطي بإحكام من الخلف باستخدام الملقط.

أدخل إبرة المحقنة في قمة القلب. يتخلل مع ثلاثة ملليلتر من HBSS بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. قطع الشريان الأورطي وإزالة القلب.

اغسل القلب في طبق بتري مع HBSS. وزن القلب المعزول ولاحظ الوزن بالملليغرام. اللحم المفروم القلب في درجة حرارة الغرفة إلى قطع صغيرة مع شفرة.

يجب أن يكون حجم قطع القلب حوالي 1.5 ملم. قم بقياس كتلة أنسجة القلب باستخدام الميزان وضع 60 ملليغرام من القلب المفروم ليتم هضمه في أنبوب سعة 15 ملليلتر على الثلج مع ثلاثة ملليلتر من HBSS. كرر هذه العملية للفأر الذي لم يتلق حقن الأجسام المضادة B220 وضعه في الأنبوب مع ثلاثة ملليلتر من نسيج التحكم المرجعي المسمى HBSS.

أضف إنزيمات إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة مفرومة. أضف 0.5 ميكرولتر لكل ملليغرام من DNase I ، وواحد 0.5 ميكرولتر لكل ملليجرام من كولاجيناز II ، و 0.2 ميكرولتر لكل ملليجرام من الهيالورونيداز. ضع تفاعل الهضم في شاكر لمدة 30 دقيقة بمعدل 300 دورة في الدقيقة.

يتم وضع الأنابيب في شاكر بزاوية صغيرة ، حوالي 25 درجة من الانحدار. أضف سبعة ملليلترات من HBSS إلى كل أنبوب من أنابيب التفاعل سعة 15 ملليلترا وأجهزة الطرد المركزي عند 250 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات سلزية. بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق كل حبيبات في خمسة ملليلتر من محلول تحلل ACK.

احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إضافة 10 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب ، امزج وفلتر في أنبوب سعة 50 ملليلتر بمصفاة 40 ميكرومتر. حطم أي حطام على المرشح باستخدام مكبس حقنة لضمان مرور جميع المواد عبر الفلتر.

بعد إضافة PBS من خلال المرشح حتى يصل الحجم إلى 25 ملليلتر لكل قلب ، أضف 25 ملليلترا إضافيا من PBS إلى أنبوب أنسجة التحكم المرجعي وقسم الحجم إلى أنبوبين مختلفين. قم بتسمية أحد الأنابيب غير ملوث والآخر حي / ميت. بعد الطرد المركزي عند 250 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بصب المادة الطافية وأعد تعليق الأنبوب غير الملوث في 100 ميكرولتر من PBS وكل من الكريات الأخرى في 100 ميكرولتر من محلول البقع الحية / الميتة.

احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل عينة ، قم بنقلها إلى أنبوب FACS من خلال مرشح 40 ميكرومتر. بعد رفض أنابيب FACS عند 250 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مخزن FACS.

أضف 50 ميكرولتر من محلول حجب FC إلى كل أنبوب ، باستثناء الأنابيب غير الملوثة والحية / الميتة. تخلط واحتضان لمدة خمس دقائق. بعد إضافة 50 ميكرولتر من محلول مزيج الأجسام المضادة إلى كل أنبوب ، باستثناء الأنابيب غير الملوثة والحية / الميتة ، احتضنها لمدة 30 دقيقة في الظلام ، وقم بتغطية دلو الثلج بورق الألمنيوم.

كما هو الحال مع البقعة الحية / الميتة ، اغسل مرة أخرى ب 500 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت وأعد تعليقه في 300 إلى 500 ميكرولتر من محلول FACS. افتح برنامج التحكم في الأداة. في الجزء العلوي من النافذة ، حدد علامة التبويب الاستحواذ وانقر فوق جديد.

في قسم المكتبة ، في الحقل اكتب للتصفية ، اكتب PE و PerCP-Cy5.5 و Brilliant violet 421 و Alexa Fluor 700 و Zombie Aqua ، وحدد fluoro-4 وانقر فوق إضافة بعد كتابة كل منها. ثم انقر فوق التالي للمتابعة إلى علامة التبويب المجموعات. الآن انقر على الرمز مع أنبوب لإضافة القلب للتحليل.

انقر فوق المجموعة المرجعية وسيتم عرض نافذة. في عمود علامات الفلورسنت ، حدد Zombie Aqua كعلامة فلورسنت ، واحذف أي علامات أخرى بالنقر فوق رمز سلة المهملات الأحمر بجوار كل منها. ثم ، في رمز نوع التحكم ، حدد الخلايا.

ثم انقر على حفظ. انقر فوق التالي. ثم انقر فوق علامة التبويب علامات.

سيتم عرض جدول. اكتب علامة الخلية المقابلة في الصف الأول من كل عمود fluoro-4 ، واضغط على Enter. انقر فوق التالي مرتين للانتقال إلى علامة التبويب اكتساب.

في الأحداث لتسجيل العينات التجريبية ، اكتب 10 ملايين ، وفي نفس الحقل لسطر المجموعة المرجعية ، اكتب 200 ، 000. انقر فوق حفظ وفتح. في أسفل اليسار ، انقر فوق التحكم في الأداة.

اضبط الجهد على FSC 50 ، SSC 175 ، SSC-B 175. حدد عنصر التحكم في الاستحواذ. بالنسبة لخيار معدل التدفق ، حدد مرتفع من القائمة المنسدلة.

دوامة أنبوب القلب غير الملوث ووضعه بإحكام على منفذ حقن العينة. تأكد من أن سهم المؤشر الأخضر يشير إلى العينة الصحيحة. ثم انقر فوق تسجيل وانتظر حتى يتم تسجيل الأحداث.

افعل الشيء نفسه بالنسبة لأنسجة القلب الحية / الميتة الملطخة. حدد قائمة Unmix وقم بتعيين عناصر التحكم. حدد خانة الاختيار التألق التلقائي كعلامة فلورسنت.

ثم اضغط التالى للمتابعة إلى علامة التبويب تحديد السكان الإيجابيين / السلبيين. في علامة التبويب هذه، سيتم عرض مخطط لمنطقة التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الجانبية. انقر واسحب نقاط المضلع لتحديد مساحة بين 1 و 4 ملايين على محور منطقة التشتت الأمامي وبين 0.2 و 3 ملايين على محور منطقة التشتت الجانبي.

في المخطط التالي إلى اليمين ، سيتم عرض V5-A على المحور X. حرك البوابات لتحديد نصف القمة في أقصى اليمين على أنها موجبة ، ومنطقة على الجانب الأيسر من المخطط على أنها سالبة. في الرسم بعنوان المجموعة المرجعية - غير ملوثة ، حدد مجموعة سكانية في نطاق مماثل.

بالنسبة للغير الملوث ، يجب عدم تحديد أي إيجابي / سلبي. انقر فوق الزر Live Unmix. الآن احصل على العينات التجريبية ، وقم بتدوير الأنبوب ، وضعه بشكل آمن على SIP.

تأكد من أن سهم المؤشر الأخضر يشير إلى العينة الصحيحة. ثم ، انقر فوق تسجيل في لوحة التحكم في الاستحواذ لبرنامج مقياس الخلايا وانتظر حتى يتم تسجيل الأحداث. حدد علامة التبويب ورقة العمل الافتراضية غير المختلطة.

قم بإنشاء مخطط FCS-A مقابل SSC-A باستخدام أداة الرسم النقطي في الأعلى. حدد أحداثا أعلى من 0.4 مليون على محور FSC-A وأعلى من 0.8 مليون على محور SSC-A باستخدام أداة تحديد المضلع. قم بإنشاء مخطط جديد بالنقر المزدوج فوق التحديد ، وفي هذه المؤامرة الجديدة ، انقر بزر الماوس الأيمن على ملصق المحور Y وحدد صبغة حية / ميتة.

انقر بزر الماوس الأيمن على ملصق المحور X وحدد التألق التلقائي A.حدد جميع الأحداث أدناه من 10 إلى الخامس على المحور الحي / الميت. هذه هي الخلايا الحية. انقر نقرا مزدوجا في هذا التحديد.

في المخطط الجديد ، حدد PerCP-Cy5.5A للمحور X و SSC-A للمحور Y. حدد السكان على الجانب الأيمن من PerCP-Cy5.5A. هذه هي الخلايا المناعية.

انقر نقرا مزدوجا فوق التحديد. في المخطط الجديد ، حدد FSC-A للمحور X وارتفاع التشتت الأمامي للمحور Y. حدد الأحداث التي تتبع اتجاها تكون فيه قيمة FSC-A وقيمة SSC-A متماثلة.

هذا يحدد خلايا مفردة ويزيل الزوجي. انقر نقرا مزدوجا فوق هذا التحديد لعرض مخطط جديد في مجتمع الخلية المفردة الإيجابي CD45. من مخطط السكان أحادي الخلية الإيجابي CD45 ، حدد اللون البنفسجي اللامع 421 على المحور X مقابل SSC-A على المحور Y.

حدد السكان إلى اليمين على المحور البنفسجي 421 اللامع. هذا هو عدد الخلايا البائية. انقر نقرا مزدوجا مرتين في هذه المجموعة لإنشاء مخططين جديدين مع مجتمع الخلايا البائية.

قم بإعداد أول مخطط للخلية B باستخدام PEA على المحور X والبنفسجي اللامع 421A على المحور Y. المجتمع الإحصائي الموجود على اليمين يناظر الخلايا البائية بين الأوعية الدموية، ويمثل المجتمع الإحصائي الموجود على اليسار الخلايا البائية البينية. حدد كليهما.

قم بإعداد مخطط الخلية B الثاني باستخدام Alexa Fluor 700A على المحور X و SSC-A على المحور Y. يتوافق المجتمع الإحصائي على اليسار مع الخلايا السالبة CD11b ، وتتوافق الأحداث الموجودة على اليمين مع الخلايا الإيجابية CD11b. انقر بزر الماوس الأيمن فوق كل قسم ثم انقر فوق خصائص البوابة.

انقر فوق Count و Parent لعرض عدد الأحداث والنسب المئوية للسكان الأصليين. سجل عدد الأحداث والنسب المئوية لمزيد من تحليل البيانات. بعد إزالة الثنائيات في قلب ساذج غير مصاب ، من المتوقع أن تكون حوالي 20٪ من الخلايا الإيجابية ل CD45 خلايا بائية إيجابية CD19.

من هذه الخلايا ، في المتوسط ، 5.5 ٪توجد في الفضاء الخلالي. 94.5٪ في الفضاء داخل الأوعية. من إجمالي عدد الخلايا البائية الموجودة في القلب ، يتوافق حوالي 1.6٪ فقط مع خلايا B1 بناء على علامة السطح CD11b و 98.4٪ الأخرى تتوافق مع خلايا B2.

عند تحليل الخلايا البائية لعضلة القلب عبر قياس التدفق الخلوي ، من الضروري أن تثقب القلب وتفرمه بشكل صحيح باتباع البروتوكول. الترشيح السليم للقلب المهضوم ضروري أيضا لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا المناعية.