تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

يوفر هذا البروتوكول طريقة عزل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين حجم فوهة رش الهواء وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة والجهد والكسب ومعلمات عتبة التشغيل.

يوفر هذا البروتوكول طريقة حل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين معلمات فرز قياس التدفق الخلوي. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعات تمثيلية من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية باستخدام التشتت الأمامي مقابل حجم التشتت فقط. ابدأ بتنفيذ إجراء بدء التشغيل القياسي لفارز خلايا التدفق.

قم بتشغيل الجهاز بالضغط على زر بدء التشغيل ، ثم انقر فوق زر طاقة الليزر في لوحة تحكم الليزر. اضغط على زر خزانات التغيير في القائمة الفرعية Smart Sampler للضغط على السوائل. استخدم طائرة نفاثة وفوهة هواء 50 ميكرومتر يتم تنظيفها بالموجات فوق الصوتية وقم بتثبيتها على مجموعة الفوهة.

اضبط الضغط على 80 SI لسائل الغلاف و 80.3 SI لتدفق العينة على وحدة الضغط. اضغط على زر بدء تدفق الغمد لبدء تدفق الغمد. انقر زر الفقاعة في القائمة الفرعية Smart Sampler لفك الفقاعات تلقائيا لمدة 10 دقائق ثم قم بإيقاف تشغيلها.

لمحاذاة الدفق وتحديد بقعة الليزر ، قم بتشغيل ضوء غرفة الإضاءة لعرض الدفق فوق الثقوب. اضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل ولليسار واليمين والأمام والخلف لتوسيط الدفق على الثقب وتركيز الدفق. افتح جميع مصاريع الليزر ، وحدد علامة تبويب اعتراض الليزر والتيار ، ثم اضغط على زر السهم الأخضر باستمرار كما يطلب منك إكمال عملية معايرة اعتراض الليزر ومحاذاة الفوهة.

قم بالوصول إلى شاشة محاذاة الليزر الدقيقة. حدد قناة تمرير النطاق الترددي 640 نانومتر و 772 بار 44 كمعلمة المحور السيني وقناة الليزر 405 نانومتر وقناة تمرير النطاق 448 بار 59 كمعلمة المحور ص. اضغط على محدد معلمة الزناد واختر معلمة التشتت الأمامي لليزر 488 نانومتر.

بعد ذلك ، قم بتخفيف جزيئات الفلورسنت قوس قزح عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج إلى تركيز نهائي قدره واحد في 10 أس حبات سادسة لكل ملليلتر. افتح باب غرفة العينة وقم بتحميل أنبوب من جزيئات الفلورسنت قوس قزح المحضرة. اضغط على زر بدء العينة واضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل لتحسين شدة التألق ، مما يجعل كل إشارة مكثفة قدر الإمكان.

اضغط على زر بدء مراقبة الجودة أو مراقبة الجودة على لوحة التحكم التي تعمل باللمس لأداء مراقبة الجودة تلقائيا. ثم اضغط على زر تهيئة IntelliSort. يقوم الجهاز تلقائيا بضبط تردد وسعة تذبذب القطرة للحصول على تأخير السقوط البالغ 25 تقريبا ويكون قادرا على تصور نقطة انقطاع السقوط بوضوح.

بعد ذلك ، اضغط على زر تأخير الإسقاط وزر الصيانة. حدد الأنبوب كنوع إخراج الفرز. ضع حامل أنبوب سعة 15 ملليلتر في حجرة الفرز.

قم بتشغيل جهد اللوحة واضبط جهد اللوحة على حوالي 4،000 فولت. بعد ذلك ، قم بتشغيل نمط الاختبار عن طريق تحديد زر إعداد البث. اضبط شريط تمرير مرحلة الشحن ومنزلق الانحراف للتأكد من أن صورة الدفق تتماشى مع أنبوب التجميع.

ثم حدد زر علامة الاختيار. قم بتسجيل الدخول إلى محطة عمل Summit على الكمبيوتر. قم بإنشاء بروتوكول جديد من القائمة الرئيسية للملف.

ثم قم بإنشاء مخطط نقطي عن طريق تحديد علامة تبويب الرسم البياني في لوحة تحكم برنامج القمة. اختر التشتت الأمامي كمعلمة المحور السيني والتشتت الجانبي كمعلمة المحور ص. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على محور مخطط النقاط الجديد في مساحة العمل وقدم المبعثر الأمامي والتشتت الجانبي في الشكل اللوغاريتمي.

حدد علامة تبويب الاكتساب وحدد موقع لوحة معلمات الاستحواذ. قم بتمكين جميع الإشارات في القائمة الفرعية لتمكين المعلمات. اختر التشتت الأمامي كمعلمة تشغيل وقم بتعيين عتبة 0.01.

اضبط الجهد والكسب للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي عند 250 و 0.6 لضمان فصل الأحداث داخل مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي والسكان. قم بتخفيف الكريات المجهرية الفلورية من البوليسترين إلى معلقات 100 و 200 و 300 نانومتر عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من الكريات المجهرية إلى ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج. ثم قم بتحميل تعليق المجهرية على التوالي.

حدد ابدأ ضمن قائمة الاستحواذ الخاصة ب Summit Software لتسجيل أحداث 20،000 ثم انقر فوق إيقاف بعد تسجيل الأحداث. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مخطط نقطة التشتت الأمامي مقابل نقطة التشتت الجانبية لإنشاء مستطيلات واسحب لتغيير الحجم. قم بتغيير موضع مناطق الضوضاء الإلكترونية وعدد الميكروسفير 100 نانومتر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على المناطق لإعادة تسميتها باسم R7 و R4 على التوالي.

كرر الخطوات لتأطير الكرات المجهرية 200 و 300 نانومتر مع المستطيلات على التوالي ، وإعادة تسميتها ك R5 و R6 على التوالي. أخيرا ، حدد منطقة الفرز من 50 إلى 200 نانومتر بناء على الضوضاء الإلكترونية وموضع جسيمات 200 نانومتر لتعريفها على أنها R8. قم بتحرير قرارات الفرز في لوحة منطق الفرز والإحصائيات بالنقر المزدوج فوق الحقل الفارغ للحقل الأيسر أو دفق L1 وتحديد المنطقة المسماة R8 لإنشاء منطق الفرز. اختر وضع إجهاض النقاء وحدد مغلف قطرة فوق قطرة واحدة لتيار L1.

قم بتحميل عينة 500 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية المعدة مسبقا أو خليط EVs. اضغط على زر البدء أسفل قائمة الاستحواذ في Summit للحصول على البيانات ثم انقر فوق إيقاف. بعد ذلك ، اضغط على ابدأ في قائمة الفرز لجمع 50 إلى 200 نانومتر من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية أو sEV في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.

كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للكرات المجهرية المصنوعة من البوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد نطاق الحجم من 50 إلى 200 نانومتر في مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي عن إشارات جسيمات مميزة. تشير R4 و R5 و R6 إلى مواضع جسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر على التوالي. R7 هو الضوضاء الإلكترونية كحد الكشف عن جسيمات 50 نانومتر و R8 يمثل نطاق الموضع من 50 إلى 200 نانومتر من الجسيمات.

كان توزيع حجم الجسيمات لخليط EVs المشتق من خلايا البنكرياس عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو NTA ، في نطاق واسع من 40 إلى 400 نانومتر بعد الطرد المركزي الفائق. تم إجراء الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية 50 إلى 200 نانومتر sEV داخل منطقة R8. تم التحقق من جودة العزل بواسطة NTA ووجد أن نطاق حجم الجسيمات من sEV بعد الفرز كان بين 50 إلى 200 نانومتر.

تمت ملاحظة وجود sEV بواسطة TEM وتم تأكيد احتواء sEVs المعزولة على علامات CD6 و CD63 و CD81 بواسطة Western Blot Analysis. تسمح هذه الطريقة بفصل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية والتصنيف أو التحليل الاحترافي للحويصلات الصغيرة خارج الخلية التي تفتح العديد من التطبيقات البحثية النهائية.