تحديد حركية التشغيل في المختبر والخلوية لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري

تسمح الدراسة في حركية الأبتامير الفلورية الخلوية للمستخدم بتقييم ما إذا كانت تفاعلات صبغة الأبتامير سريعة بما يكفي لدراسة عملية ذات أهمية في الوقت الفعلي. تسمح التقنيات المقدمة بإجراء قياسات حركية كمية داخل الخلية وخارجها ، ويمكن أن يكون أي منهما ذا صلة اعتمادا على تطبيق الأبتامر. يمكن تطبيق الطرق المقدمة على أي نظام RNA فلوري ، بما في ذلك الأبتامير البديلة وأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الحمض النووي الريبي للجزيئات الصغيرة.

للبدء ، قم بإعداد برنامج إعادة تشكيل الحمض النووي الريبي من العجلة الحرارية. قم بإنشاء البرنامج عن طريق تحديد إنشاء برنامج جديد "إضافة مرحلة جديدة" وإضافة خطوة جديدة "عدة مرات لإضافة خطوات خاصة بدرجة الحرارة قبل الضغط على حفظ" ضبط الإعدادات الإضافية وفقا للبرنامج. لإعادة طبيعة السبانخ اثنين والحمض النووي الريبي البروكلي ، قم بإعداد ساقين ميكرومولار من كل حمض نووي ريبوزي (RNA) في ماء مقطر مزدوج في أنبوب PCR رقيق الجدران 0.5 ملليلتر.

ثم أضف كميات متساوية من المخزن المؤقت لإعادة تشكيل اثنين x لصنع محلول RNA ميكرومولار واحد. ضع الأنابيب في العجلة الحرارية. افتح برنامج إعادة التشكيل المحفوظ واضغط على تشغيل"بعد ذلك ، قم بإعداد برنامج حاقن قارئ اللوحة.

على قارئ لوحة مضان ، حدد درجة الحرارة"واضبطه على 37 درجة مئوية. قبل البدء في الحركية ، تأكد من توازن درجة الحرارة مع هذه القيمة. افتح برنامج قارئ اللوحة.

حدد الإعدادات "ثم عرض الاستحواذ" لإدخال البرنامج للقياسات الحركية ، حدد حلقة "لكل بئر. بعد ذلك ، اضبط إعداد خط الأساس على 60 قراءة أساسية وإعدادات حقن ذكية لحقن 10 ميكرولتر. اضبط الطول الموجي لقراءة الإثارة إلى 448 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث إلى 506 نانومتر والخرطوشة إلى أحادية.

اضبط إجمالي وقت القراءة على 10 دقائق مع فاصل قراءة يبلغ 0.5 ثانية. اضبط PMT والبصريات على ست ومضات لكل قراءة. ثم أدخل حلقة إلى البئر التالي.

لتحضير حاقن قارئ اللوحة ، حدد حقن "على قارئ اللوحة وقم بتزويد لوحة تجميع النفايات عند توجيهها. ثم حدد غسل" ونظف أنبوب الحقن باتباع التعليمات الموجودة على قارئ اللوحة بأحجام ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج ، و 75٪ من الإيثانول ، ثم الماء المقطر. حدد التالي نضح "السماح للحاقن بإخراج السائل الزائد.

ثم حدد رئيس الوزراء "لتجهيز الحاقن مع اثنين من 260 ميكرولتر من 100 ميكرومولار D F H B I.To إجراء تجربة حركية واحدة إضافة 80 ميكرولتر من مزيج سيد عازلة ملزمة إلى بئر واحد من 96 لوحة سفلية واضحة جيدا. ثم أضف 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعاد تشكيله. اترك اللوحة ومحلول D F H B I في الحاقن ، ليتوازن إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، حدد البئر المراد تحليلها في إعدادات البرنامج ضمن منطقة القراءة. ثم ضمن علامة التبويب الصفحة الرئيسية ، حدد تشغيل "لتنفيذ برنامج الحركية الموصوف سابقا. كرر هذه العملية حتى تكتمل جميع التجارب.

بعد الجري ، اغسل الحاقن لإزالة محلول D F H B I المتبقي من أنبوب الحقن كما هو موضح سابقا. لإعداد الملفات التجريبية ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي والكمبيوتر. قم بإنشاء ملف جديد داخل علامة تبويب مستكشف التجربة بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق مقياس التدفق الخلوي "اسم المستخدم".

ثم حدد تجربة جديدة "في النافذة المنسدلة وعندما تنبثق نافذة جديدة على شاشة الكمبيوتر ، حدد نوع التجربة كأنابيب" ثم حدد حسنا "في ملف التجربة الجديد ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد المجموعة وحدد إضافة أنبوب عينة جديد "تسمية أنابيب العينة لكل نقطة زمنية محددة وتكرارها بالنقر بزر الماوس الأيمن على عينة" وتحديد إعادة تسمية "في القائمة المنسدلة. بعد ذلك، قم بإعداد محلول خلوي مخفف بإضافة 1.5 ملليلتر من X P B S وثلاثة ميكرولترات من الخلايا المستحثة في الذكاء الاصطناعي الوسط في أنبوب الثقافة. قبل إضافة الصبغة ، قم بقياس مضان الخلفية للخلايا لمراقبة تشغيل الطية بمرور الوقت.

بمجرد إضافة الصبغة ، ضع أنبوب الاستزراع الذي يحتوي على خلايا في P B S في رافع أنبوب العينة وارفع الرافع إلى إبرة حقن العينة. ثم حدد ملف العينة المناسب داخل علامة تبويب لوحة التجميع وانقر فوق تسجيل "بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بخفض رافع أنبوب العينة باستخدام أنبوب الثقافة يدويا. لبدء خطوة الشطف ، لشطف نظام السوائل ، وتقليل الترحيل بين كل عينة بيولوجية مكررة.

للانتقال إلى النموذج التالي، حدد ملف العينة التالي بالنقر فوق رمز السهم الأيمن بالقرب من اسم أنبوب العينة أسفل أيقونة التسجيل. لقياس مضان الخلايا بالصبغة ، أضف 1.4 ميكرولتر من مخزون الصبغة المركزة إلى واحد X P B S مع الخلايا ، لإعطاء تركيز نهائي قدره 50 ميكرومولار D F H B I واحد T.قم بتأمين غطاء أنبوب الثقافة وقلب ثلاث إلى خمس مرات لخلط المحلول بالتساوي. بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء ووضع أنبوب الثقافة في رافع أنبوب العينة.

بعد رفع الحامل إلى إبرة حقن العينة ، انقر فوق رمز السجل "أسفل ملف العينة المناسب. بعد ذلك ، ابدأ مؤقتا بالضغط على start"في الحركية المختبرية للأبتامير الفلوروجينية السبانخ الثانية والبروكلي ، عرضت حركية الارتباط على مرحلتين للربط بصبغة D F H B I. بالنسبة لكل من الأبتامير ، تم تجهيز بيانات الحركية بشكل أفضل من خلال الارتباط ثنائي الطور مقارنة بمرحلة واحدة في أوقات القياس الطويلة.

حدد منحنى أفضل ملاءمة ثوابت المعدل وقيم نصف العمر للارتباطات السريعة والبطيئة. السبانخ اثنان في حالة الكفاءة ملزمة ، أظهرت تشغيل أسرع من البروكلي. حركية المرحلة الثانية لكل من الأبتامير متشابهة وقد تتوافق مع خطوة مشتركة للحد من المعدل.

تتكون منحنيات الأبتامير الحركية من درجة مماثلة من الحمض النووي الريبي سريع الارتباط. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن السبانخ اثنين من T RNA ، يزداد متوسط شدة التألق أو M F I على الفور عند نقطة زمنية صفرية. علاوة على ذلك ، وصل التألق الخلوي إلى أقصى قيمة متوازنة M F I في غضون خمس دقائق.

في المقابل ، أظهرت خلايا التحكم مضان منخفض في الخلفية وعدم وجود تغيير في قيم M F I مع إضافة D M S O تسمح الطرق المقدمة للباحثين بتحديد كيف يمكنهم جعل أجهزة الاستشعار القائمة على الحمض النووي الريبي في الأبتامير الفلورية أسرع.