معالجة القضايا العملية في المسافة البادئة الدقيقة القائمة على مجهر القوة الذرية على نباتات الغضروف المفصلي البشري
أكتوبر 28, 2022
نقدم نهجا خطوة بخطوة لتحديد ومعالجة المشكلات الأكثر شيوعا المرتبطة بالمسافات البادئة الدقيقة للقوة الذرية. نحن نمثل المشاكل الناشئة في نباتات الغضاريف المفصلية البشرية الأصلية التي تتميز بدرجات مختلفة من التنكس الناجم عن هشاشة العظام.
كان الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج في المختبر لدراسة الخواص الميكانيكية للغضروف المفصلي أثناء بداية وتطور هشاشة العظام. الميزة الرئيسية للتقنية الحالية هي أن نباتات الغضروف سهلة التوليد وممثلة بشكل كبير لغضروف العمر الأصلي. يمكن استخدام هذا النموذج لتحليل ومراقبة مختلف هشاشة العظام والتشخيص والأساليب العلاجية على المستوى الميكانيكي الحيوي.
للبدء ، اقطع الغضروف بعيدا عن العظم باستخدام مشرط. باستخدام لكمة خزعة ، قم بإنشاء أقراص قطرها أربعة ملليمترات. ضع القرص على جهاز قطع مخصص.
باستخدام ملعقة ، قم بإصلاح وتثبيت قرص الغضروف. قطع القرص الغضروفي بشفرة الحلاقة. باستخدام ملعقة ، اجمع القرص وضعه في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
للبقاء في عينات الغضروف ، أضف 130 ميكرولترا من صبغة مضان نفاذية للخلايا إلى كل بئر من 96 صفيحة بئر ووزع القرص على اللوحة كقرص واحد لكل بئر. ضع لوحة البئر 96 على حامل لوحة المجهر الفلوري. حدد مرشح التألق المناسب والهدف.
ضع الهدف أسفل البئر المحدد مسبقا الذي يحتوي على غضروف فردي. ركز على القرص لرؤية النمط الخلوي. حدد وظيفة الملاح للحصول على نظرة عامة على البئر بالكامل.
استخدم زر الماوس الأيسر واسحبه للانتقال إلى موضع مرحلة مختلف. حدد مربعا يشمل منطقة الاهتمام المراد مسحها ضوئيا. حدد خيار نقطة تركيز خريطة البرنامج ثم حدد كل بلاطة فردية بالنقر بزر الماوس الأيسر في وسطها.
حدد خريطة تركيز الخيار في النافذة الظاهرة مع جميع المربعات المحددة مسبقا. انقر نقرا مزدوجا فوق البلاط لعرضه وجعله في التركيز المناسب. بعد ذلك ، انقر فوق تعيين Z لحفظ الخطة البؤرية والمتابعة إلى التجانب التالي.
بعد ضبط الخطة البؤرية لكل بلاطة فردية ، ابدأ الحصول على الصورة بالضغط على بدء المسح الضوئي. قم بإصلاح كل قرص غضروفي محدد مسبقا يحتوي على نمط خلوي في أطباق بتري عن طريق إضافة غراء متوافق حيويا كافيا على الجوانب العلوية والسفلية واليسرى واليمنى من القرص. قم بتغطية الأقراص ب 2.5 ملليلتر من وسط Leibovitz بدون L-glutamine.
ضع طبق بتري في حامل عينات أجهزة AFM. لمعايرة الكابولي AFM ، ضعه على سطح ناتئ الكتلة الزجاجية بحيث يستقر على المستوى البصري المصقول في وسط الكتلة الزجاجية. اخفض الكابولي في خطوات 100 ميكرومتر باستخدام وظيفة محرك السائر حتى يتم غمره بالكامل في الوسط.
لتحديد موقع قياس الغضروف المطلوب ، ابدأ نهج الماسح الضوئي باستخدام الكابولي على منطقة خالية من العينات النظيفة من طبق بتري. ثم اسحب الكابولي على بعد 1.5 ملم من أسفل اللوحة. قم بالتبديل من عرض برايتفيلد إلى عرض مضان وحدد الجزء العلوي من القرص بصريا.
حرك حامل عينة AFM بالضبط مليمترين باتجاه منتصف القرص. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي للوصول إلى سطح قرص الغضروف وسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر. لتوليد منحنى مسافة القوة ، ركز على الخلايا الموضوعة في موقع القياس المطلوب.
انقر فوق زر التشغيل لبدء القياسات والحصول على خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع قياس. احفظ المنحنيات بمجرد فحصها. لتقدير معامل يونغ ، باستخدام خيار فتح مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي ، افتح منحنيات مسافة القوة المتولدة ليتم تحليلها.
حدد طراز Hertz-fit متبوعا بخيار ملاءمة المرونة. ثم تصور وتوثيق معامل يونغ. التكيف باستخدام نسبة بواسون 0.5 ونصف قطر طرف الكابولي المناسب.
ثم تحقق بصريا من ملاءمة منحنى مسافة القوة لضمان صحتها. لتحديد عمق المسافة البادئة ، افتح كل من منحنيات مسافة القوة المتولدة في برنامج تحليل البيانات وحدد نموذج Hertz-fit كعملية تحليل. قم بتطبيق خيار إزاحة خط الأساس المطروح على صفر محور الانحراف الرأسي وحدد دالة الإزاحة زائد الإمالة.
استخدم وظيفة البحث عن نقطة اتصال لتحديد نقطة الاتصال تلقائيا. باستخدام دالة موضع الطرف الرأسي ، اطرح المسافة التي تمثل فقط انحراف الكابولي من ارتفاع بيزو الخام أثناء المسافة البادئة. حدد خيار ملاءمة المرونة لعرض منحنى مسافة القوة المعالجة.
ثم حدد مساحة الرسم البياني بحيث تصطف مع القيمة الأكثر سالبة على محور موضع الطرف الرأسي. في علامة تبويب المعلمات من مربع XMIN، اقرأ المسافة البادئة وقم بتوثيقها. أظهرت الأقراص التي تحتوي على سلاسل مفردة قيم صلابة أعلى بمتوسط 2.6 كيلو باسكال ، وهو ما يمثل مناطق الغضاريف الصحية غير المنقوصة.
مع بداية هشاشة العظام وتطورها ، أظهرت قياسات AFM انخفاضا قويا متدرجا في الصلابة بنسبة 42٪ في الأوتار المزدوجة ، و 77٪ في المجموعات الصغيرة ، وفي النهاية 88٪ في المراحل المتقدمة التي تمثلها المجموعات الكبيرة. الأقراص التي تحتوي على نمط منتشر معروضة بمرونة عالية مع اختلاف مهم في القيم الفردية لمعامل يونغ. بالنسبة لجميع أقراص الغضاريف ذات تنظيم النمط الخلوي السائد المعين ، وجد أن عمق المسافة البادئة المرتبط بنقطة الضبط المستخدمة يتناسب عكسيا مع الصلابة.
تشير القطع الأثرية التي شوهدت في منحنيات مسافة القوة المتولدة إما إلى اتصال دون المستوى الأمثل بين ناتئ AFM وسطح الغضروف أو تثبيت عينة غير صحيح لطبق بتري. يمكن معالجة غضاريف الغضاريف وتحليلها باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات البيولوجية الجزيئية مثل تحليل البروتين عبر إليزا ، أو وضع العلامات المناعية ، أو التعديل الغربي ، أو التحليل العام عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التأثير المباشر للعلاجات الجديدة على الغضروف المفصلي وقد تساعد الباحثين على اكتساب رؤى مهمة حول آليات التهاب المفاصل العظمي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لإنشاء نموذج in vitro لدراسة الخصائص الميكانيكية للغضروف المفصلي أثناء تقدم هشاشة العظام. تركز الطريقة على استخدام قطع الغضروف البشري الأصلي، التي يسهل إنتاجها وتمثل التغيرات المرتبطة بالعمر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- الميكانيكا الحيوية
الخلفية
- هشاشة العظام هي مرض تنكسي في المفاصل يؤثر على الغضروف.
- فهم ميكانيكا الغضروف ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية.
- قد لا تمثل النماذج الحالية خصائص الغضروف الأصلي بدقة.
- تهدف هذه الدراسة إلى معالجة هذه الثغرات باستخدام نهج in vitro جديد.
هدف الدراسة
- إنشاء نموذج in vitro موثوق به لدراسة ميكانيكا الغضروف.
- تسهيل تحليل تقدم هشاشة العظام.
- لتقييم النهج التشخيصية والعلاجية على المستوى الميكانيكي الحيوي.
الطرق المستخدمة
- يتم قطع الغضروف من العظم باستخدام مشرط.
- توليد أقراص قطرها أربعة ملليمترات باستخدام مثقاب خزعة.
- يتم وضع الأقراص على جهاز قطع مخصص لتحليلها بشكل أكبر.
- يتم استخدام ميكرو-الاختراق المجهري للقوة الذرية لتقييم الخصائص الميكانيكية.
النتائج الرئيسية
- نجح البروتوكول في توليد قطع غضروف تحاكي الظروف الطبيعية.
- يمكن مراقبة الخصائص الميكانيكية للغضروف بشكل فعال.
- تم تحديد المشاكل الناشئة المرتبطة بالتقنية ومعالجتها.
- يوفر هذا النموذج رؤى حول تشخيصات وعلاجات هشاشة العظام.
الاستنتاجات
- النموذج in vitro هو أداة قيمة لدراسة هشاشة العظام.
- يسمح بفحص ميكانيكا الغضروف في بيئة خاضعة للرقابة.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذا النموذج لاستكشاف التدخلات العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM)-based micro-indentation on human articular cartilage explants enables precise biomechanical profiling critical for early osteoarthritis research. Addressing practical artifacts in AFM workflows enhances predictive confidence in mechanical property measurements, supporting robust target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical evaluation of disease-modifying interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cartilage mechanical properties across disease stages.
- Supports functional target validation by linking biomechanical changes to osteoarthritis progression.
- Facilitates mechanistic de-risking by identifying artifacts and ensuring data integrity.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo systems for reproducible biomechanical assays.
- Standardizes sample preparation and AFM protocols to minimize measurement artifacts.
- Delivers quantitative Young's modulus and indentation depth outputs for compound evaluation.
- Enables reliable screening of therapeutic candidates targeting cartilage integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomechanical readouts with disease-relevant human tissue models.
- Provides continuity from discovery-stage findings to preclinical validation of therapeutic impact.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying mechanical endpoints in osteoarthritis models.
- Facilitates integration with molecular analyses for comprehensive biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This AFM-based micro-indentation protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research in osteoarthritis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven assessment of cartilage degeneration mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biomechanical outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers force-distance curves, Young's modulus, and indentation depth for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges ex vivo findings to preclinical evaluation of therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable workflow for cartilage biomechanics across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cartilage research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biomechanical assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes capital allocation in osteoarthritis portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of disease-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and biomechanical data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and fluorescence imaging platforms.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and data processing.
- May require adaptation for different cartilage sources or disease models.
- Attention to sample-tip interaction and fixation is critical to avoid measurement artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Tissue Processing and Generation of Cartilage Discs
1:14
Cartilage Disc Staining and Sorting
2:43
Biomechanical Approach of Cartilage Explants
6:11
Results: AFM Measurements of Cartilage Discs Based on Cellular Pattern Organization
7:25
Conclusion
