تصوير فائق الدقة للبروتينات المفرزة البكتيرية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية

يتغلب توسيع الشفرة الوراثية ، أو GCE ، على قيود استراتيجيات وضع العلامات الأخرى. إنها تمكننا من تحديد موقع البروتينات الموسومة على وجه التحديد ، ولدينا فلوروفورات عضوية ساطعة تمكن من تصورها ، حتى نتمكن من تجنب الاستراتيجيات التي تصنع ، على سبيل المثال ، اندماج البروتين الفلوري ، والذي يمكن أن يعطل وظيفة البروتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام آخر.

على سبيل المثال ، استخدمناه لتسمية بروتين زيكا أول أكسيد الكربون ، وهذا يمكننا من توفير وإنتاج فيروس زيكا المسمى الذي يمكننا بعد ذلك مراقبة إصابة الخلايا المضيفة. للبدء ، انقل 100 ميكرولتر من الثقافة الأولية إلى خمسة ملليلتر من وسط LB يحتوي على 35 ميكروغرام لكل مليلتر كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.6.

استبدل الوسط LB بالوسط N-minimal المعدل المكمل ب TCO واحد مليمولار ، وهو حمض أميني غير قانوني. وتنمو البكتيريا عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 0.2٪ أرابينوز ، و 25 ملليغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول ، و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين ، وقم بتنمية الخلايا لمدة ست ساعات أخرى ، واهتز عند 250 دورة في الدقيقة.

بعد ست ساعات ، اغسل البكتيريا أربع مرات على مدار 30 دقيقة باستخدام وسائط MgM الطازجة بدون أحماض أمينية غير قانونية أو ncAA. قم بطرد البكتيريا ، وأعد تعليقها في مخزن PBS المؤقت ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام لإزالة NCAAs الزائدة. بعد ساعة واحدة ، قم بطرد البكتيريا عند 3،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بتخزينها لاستخدامها مرة أخرى.

بالنسبة لتجربة التحكم ، كرر نفس التجربة عن طريق التعبير عن البروتينات الحاملة ل ncAA في حالة عدم وجود ncAA. إعادة تعليق خلايا السالمونيلا التي تعبر عن SseJ المدمجة مع TCO في غياب أو وجود TCO في PBS. اضبط الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى أربعة في PBS ، واحتضن الخلايا ب 20 ميكرومولار Janelia Fluor 646 tetrazene أو 20 micromolar BDPFL tetrazine عند 37 درجة مئوية في الظلام ، واهتز لمدة ساعة إلى ساعتين عند 250 دورة في الدقيقة.

حبيبات الخلايا وغسلها ثلاث إلى أربع مرات مع PBS التي تحتوي على 5٪ DMSO و 0.2٪ Pluronic F-127. أعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ DMSO. بعد الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام ، اغسل مرتين مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني.

تخيل الخلايا على الفور باستخدام مجهر متحد البؤر ، أو قم بتثبيتها باستخدام 1.5٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. استزراع خلايا هيلا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة في نسبة الجلوكوز العالية DMEM مع 10٪ FBS بالإضافة إلى البنسلين الستربتومايسين. استزرع البكتيريا قبل يوم واحد من الإصابة وتلقيح مستعمرة واحدة من السالمونيلا من النوع البري التي تؤوي بلازميد pEVOL الذي يحتوي على زوج توليف tRNA المتعامد وبلازميد pWSK29 الذي يحتوي على جين SseJ في خمسة ملليمترات من المضادات الحيوية التي تحتوي على مرق LB القياسي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.

إصلاح مخزون الخلايا المخففة عند 100،000 خلية لكل مليلتر والبذور 50،000 خلية HeLA لكل بئر في 500 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ من وسط نمو FBS في شريحة من ثماني غرف جيدة. حافظ على شريحة الحجرة في حاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بالنسبة للعدوى البكتيرية ، فإن السالمونيلا من النوع البري التي تحتوي على بلازميد pEVOL وبلازميد pWSK29 المحتوي على جين SseJ عن طريق تخفيف 100 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية الليلية إلى ثلاثة ملليلتر من وسط LB يحتوي على 35 ميكروغرام لكل مليلتر كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين.

احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى سبع ساعات. لبدء عدوى خلايا هيلا ، بعد إخراج خلايا هيلا من الحاضنة ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا ، وأضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى كل بئر. ضع شريحة الحجرة مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى تبدأ العدوى.

بعد خمس إلى سبع ساعات من الحضانة ، قم بتخفيف ثقافة السالمونيلا بحيث تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر 0.2 في ملليلتر واحد من وسط نمو DMEM ، وإضافة الكميات المطلوبة من لقاح السالمونيلا إلى كل بئر من شريحة الغرفة ، بحيث يكون تعدد العدوى 100. بعد احتضان الخلايا المصابة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS المسخن مسبقا لإزالة السالمونيلا خارج الخلية. اضبط هذه النقطة الزمنية على صفر ساعة بعد الإصابة ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، مرة أخرى ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS كما هو موضح سابقا وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل المكمل ب 0.2٪ أرابينوز ، 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين إلى كل بئر من شريحة الغرفة. في تجربة التحكم ، قم بإجراء عدوى مماثلة لخلايا هيلا بدون التكلفة الإجمالية للملكية. بعد احتضان شريحة الغرفة لمدة 10 ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ، استبدل الوسط الكامل بوسط كامل جديد بدون TCO ، واغسل خلايا HeLa أربع مرات على مدار 30 دقيقة لكل منها DPBS مسخن مسبقا.

ثم اغسل الخلايا بوسط كامل طازج بدون TCO. بعد 12 ساعة من الإصابة ، قم بشفط الوسط من الخلايا واغسل الخلية باستخدام DPBS المسخن مسبقا مرتين أو ثلاث مرات. في مجموعة واحدة من الآبار ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة واحد ، وفي مجموعة أخرى من آبار نفس شريحة الغرفة ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة اثنين.

ضع الحجرة تنزلق مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة ونصف إلى ساعتين. بعد 13.5 إلى 14 ساعة بعد الإصابة، اشطف خلايا هيلا مرتين باستخدام DPBS المسخن مسبقا، وأضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج المكمل ب FBS. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DPBS المسخن مسبقا كما هو موضح سابقا ، ثم اغسله باستخدام DMEM الطازج أربع مرات على مدار 30 دقيقة.

في 16 ساعة بعد الإصابة ، قم بإصلاح خلايا HeLa باستخدام paraformaldehyde عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى كل بئر واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح من بارافورمالدهيد. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، وتخزين الخلايا في برنامج تلفزيوني عند أربع درجات مئوية في الظلام.

أحضر الخلايا إلى المجهر ، وضع غرفة التصوير على مرحلة المجهر في حامل العينة. ثم قم بتغيير الوسط في البئر باستخدام 0.4 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير GLOX BME المصنوع حديثا. قلل طاقة الليزر إلى حوالي واحد ملي واط لتحديد خلية HeLa ذات الأهمية وضبط المستوى البؤري وزاوية شعاع الليزر أثناء إضاءة العينة بكثافة ليزر منخفضة تبلغ 647 نانومتر.

اضبط زاوية إضاءة HILO. التقط مرجعا لصورة محدودة الكسر للهيكل المستهدف ، وقم بتبديل الفلوروفورات إلى الحالة المظلمة عن طريق تحويل الليزر إلى أقصى طاقته. اضبط كسب مكبر الصوت المسبق على ثلاثة وقم بتنشيط نقل الإطار.

ثم اضبط كسب EM على 200 للحصول على حساسية أعلى في قياسات dSTORM. اضبط قوة الليزر على مستوى مناسب حيث يتم فصل الأحداث الوامضة في المكان والزمان. اضبط وقت التعرض على 30 مللي ثانية وابدأ عملية الاستحواذ.

الحصول على 10،000 إلى 30،000 إطار. كرر عملية الاستحواذ المماثلة بعائد استثمار مختلف. لإعادة بناء صور dSTORM ، افتح الصورة J واستورد البيانات الأولية.

افتح المكون الإضافي Thunderstorm ، وقم بتكوين إعداد الكاميرا المقابل للجهاز. انتقل إلى تشغيل التحليل وتعيين الإعدادات المناسبة ، مثل تصفية الصور وطرق الترجمة وتوطين البكسل الفرعي للجزيئات. انقر فوق موافق لبدء إعادة بناء الصورة وبدء تحليل النتيجة النهائية بعد المعالجة.

يتم التعامل مع السالمونيلا التي تعبر عن SseJ المدمجة مع TCO مع Janelia Fluor 646 tetrazine ويتم تصويرها مع Janelia Fluor 646 fluorescence في غياب أو وجود TCO. يتم الكشف عن مضان SseJ فقط عند وجود TCO. تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تؤوي psseJ-HA لمدة 16 ساعة ، وهي ثابتة ومناعية بالأجسام المضادة ل HA و LPS و DAPI.

كما هو متوقع ، تتشكل خيوط السالمونيلا التي تسببها SseJ ، أو SIFs ، في الخلايا المصابة. في حالة عدم وجود TCO ، لا يتم قمع كودون الكهرمان ، و SIFs المعتمدة على SseJ غائبة في خلايا HeLa المصابة. لوحظت SIFs المعتمدة على SseJ في وجود TCO ، مما يشير بوضوح إلى أنه تم إنقاذ SseJ من خلال التعبير عن SseJF10TCOHA باستخدام توسيع الشفرة الجينية ، أو GCE.

يتم عرض خصوصية وضع العلامات على SseJF10TCOHA المفرز في خلايا HeLa من خلال تفاعلات النقر SPIEDAC باستخدام اثنين من خليط الصبغة البديل الأول وخليط الصبغة الثاني موضحة هنا. انقر فوق صبغة تم استخدام Janelia Fluor 646 TZ أيضا لمراقبة ما إذا كان هناك أي علامات خلفية في خلايا HeLa المصابة بنوع Salmanella البري الذي يحمل SseJ HA في وجود TCO و P قبو البلازميد. تم إطلاق SseJ في السيتوبلازم للخلية المضيفة مع عدم وجود إشارات فلورية داخل الخلايا أو غير محددة توضح أن إشارة الفلورسنت كانت خاصة ب SseJ.

يتم عرض تصوير فائق الدقة ل GCE المسمى SseJ في خلايا HeLa في هذا الشكل. تظهر هنا صورة برايت فيلد لخلية هيلا تحت الملاحظة. يتم عرض صورة المجال العريض المحدودة للحيود ل SseJ المفرز المسمى ب TCO و Janelia Fluor 646 وصورة dSTORM المقابلة ل SIFs المزينة ب SseJ هنا.

يعرض الإدراج طريقة عرض مكبرة ل SseJ فائق الدقة في المنطقة المحاصرة. تم إعداد حلول مخزون NCAA في NaOH. لا تنس تحييده قبل أو بعد الإضافة إلى الوسائط.

بعد وضع علامة على البروتين محل الاهتمام ، اغسل الخلية على نطاق واسع ، بحيث تكون إشارة الخلفية ضئيلة. باتباع إجراء الحملة العالمية للتعليم ، يمكننا الآن تسمية أي عامل ضراوة في البكتيريا ومتابعة نشاطه باستخدام تقنيات التصوير الخاصة بنا.