جهاز علاج ضوئي ديناميكي مدمج وقائم على الصمام الثنائي الباعث للضوء لتعزيز السمية الخلوية للفيرتيبورفين في نموذج زراعة الخلايا 2D

يوفر العلاج الضوئي الديناميكي ، PDT ، العديد من المزايا لعلاج السرطان ، وتعتمد فعاليته على مصدر الضوء لتنشيط المحسس الضوئي. على الرغم من التطورات الحديثة في هذا المجال ، إلا أن هناك نقصا في الوصول إلى جهاز مكلف وقابل للتكرار ل PTD للنماذج المختبرية. من أجل تحقيق هذا الطلب ، يصف هذا العمل جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات PDT على مزارع الخلايا ، يسمى PhotoAct.

لبدء البناء ، رأى ثلاثة ملليمترات سمك ألواح الألياف متوسطة الكثافة ، MDF ، للحصول على قطع ذات الأبعاد التالية. بناء صندوقين بالأبعاد التالية. قم بحفر الجزء الخلفي من الصندوق الأكبر لتثبيت موصل مقبس الأسطوانة.

قم أيضا بحفر الجزء العلوي من الصندوق الأكبر والجزء العلوي والسفلي من الصندوق الأصغر لتوفير ممر للكابلات الكهربائية. قم بطلاء جميع الأسطح الداخلية بالحبر الأسود لتعزيز حدوث الضوء المتجانس. قم بتوصيل ثلاثة أشرطة LED بالتوازي مع 10 مصابيح LED لكل منها على السطح الداخلي العلوي للصندوق الأصغر.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بتثبيت مستشعر سطوع في وسط السطح الداخلي السفلي للصندوق الأصغر. اطبع هيكل وحدة التحكم باستخدام ملف الطباعة 3D الإضافي. قم بتثبيت جميع المكونات ، وزر الطاقة ، ومقاييس الجهد ، ولوحة اللمس لبدء الوقت ، ومصابيح LED ، ومستشعر السطوع ، وشاشة LCD ، والجرس ، ومصدر الطاقة ، وأجزاء لوحة التحكم ESP-32 المثبتة في داخل وحدة التحكم.

قم بتحميل رمز البرمجة المتاح في ملف تكميلي ، وقم بإجراء اختبار للتحقق من أن جميع الاتصالات تعمل. قم بتجميع الصناديق وإصلاحها معا لتجنب الفجوات وبالتالي تداخل الإضاءة الخارجية وفقدان الضوء الفوري. قم بتوصيل وحدة التحكم المركبة بالمنطقة المحفورة في الجزء العلوي من النموذج الأولي.

قم ببناء باب أمامي من نفس المادة بالأبعاد التالية ، وقم بتثبيته على الصندوق الخارجي بمفصلات وأشرطة فيلكرو لضمان إغلاق الغرفة والمقايسات دون انقطاع. قم أيضا بتثبيت مقبض للتعامل مع الباب الأمامي بسهولة ودقة. قم بتوصيل أربع وسادات قدم مطاطية في الجزء السفلي من النموذج الأولي لضمان مزيد من الثبات أثناء العمليات.

قم بزراعة خط خلايا هيلا في جلوكوز النسر المتوسط المعدل من دولبيكو مع 10٪ من مصل الأبقار الجنينية و 1٪ من الجنتاميسين. حافظ على قوارير الثقافة عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. إدارة وفحص ثقافة الخلية حتى تصل إلى 80 إلى 90٪ من التقاء.

ابدأ بروتوكول صلاحية الخلية بعملية البذر. قم بإزالة الوسط من القارورة مع زراعة خلايا HeLa المتقاربة. اغسل القارورة بمحلول ملحي عازل للفوسفات ، PBS ، وافصل المزرعة باستخدام التربسين باتباع التفاصيل المميزة.

عد خلايا إعادة التعليق باستخدام مقياس الدم وزرعها في صفيحة مجهرية متعددة الآبار بتركيز 20،000 خلية لكل بئر. تحضير لوحين لظروف العلاج المظلمة والخفيفة واحتضانها لمدة 24 ساعة لربط الخلية. للمضي قدما في العلاج باستخدام محسس للضوء ، قم بإزالة الوسط من كلتا اللوحتين وعلاج الخلايا ب 100 ميكرولتر من تركيزات Verteporfin.

حافظ على الخلايا في العلاج لمدة 24 ساعة للسماح باستيعاب Verteporfin. بعد الحضانة ، قم بإزالة العلاج ، وغسل الخلايا باستخدام PBS وإضافة وسيلة خالية من المخدرات. قم بتغطية صفيحة دقيقة واحدة بورق الألمنيوم لحمايتها من التعرض للضوء واحتضانها لمدة 24 ساعة.

ستوفر هذه الصفيحة الدقيقة بيانات تحكم لمزيد من التحليل لنتائج PDT. سيتم استخدام الصفيحة الدقيقة الأخرى في حالة التعرض للضوء في PhotoAct. لتشغيل الجهاز ، قم بتوصيله بالمأخذ وتشغيله ، واضغط على زر الطاقة.

ضع الصفيحة الدقيقة متعددة الآبار في غرفة PDT وأغلق الجهاز عن طريق تثبيت الباب الأمامي بأشرطة الفيلكرو الجانبية. لإعداد الجهاز ، استخدم مقاييس الجهد لضبط تكوين RGB لانبعاث الضوء. اضغط على لوحة اللمس زائد / ناقص لضبط تكوين الوقت وتعيين مدة الفحص.

تحقق مما إذا كانت المعلومات الصحيحة حول الفحص معروضة على الشاشة وقم بإجراء التعديلات النهائية إذا لزم الأمر. اضغط على لوحة بدء اللمس لبدء الفحص. يجب سماع صفارة واحدة في بداية التجربة.

أثناء التجربة ، يمكن ملاحظة معلومات التقدم على الشاشة ، مثل الإشعاع والوقت المتبقي. لا تفتح الباب الأمامي أو تغير أي تكوين أثناء فحص PDT. في نهاية الفحص ، يجب سماع صفارة بأربعة أصوات تنبيه وسيقوم النظام الإلكتروني بإيقاف تشغيل جميع مصابيح LED.

يمكن ملاحظة الرسالة النهائية والكمية النهائية من الطاقة الموسعة أثناء التجربة على الشاشة. يتم حساب القيمة النهائية للطلاقة وفقا للمعادلة المميزة. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة التي عانت من التعرض للضوء واستمر في الحضانة على مدار 24 ساعة.

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسيط من كلا اللوحين ، واغسل الطبقة الأحادية من الخلايا باستخدام PBS ، وأضف محلول MTT. احتضان كل من اللوحات الظروف المظلمة والخفيفة لمدة أربع ساعات للسماح بتكوين بلورات الفورمازان. قم بإزالة محلول MTT بعناية وقم بإذابة البلورات الأرجوانية باستخدام محلول DMSO والإيثانول.

بعد الذوبان الكامل للبلورات ، قم بإجراء قياس الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة عند 595 نانومتر. يتكون المنتج النهائي من غرفة مظلمة مع سطحها الداخلي العلوي المجهز بمجموعة من 30 ثنائيا باعثا للضوء المتناثر ، مصابيح LED ، مبرمجة لإصدار أطياف مميزة من الضوء المرئي. يتم إنشاء حدوث ضوء متجانس بسبب انخفاض انعكاس الأسطح الداخلية والتوزيع الموحد لتكوين مصابيح LED.

واجهة الإعداد سهلة الاستخدام وكانت الحالة التجريبية المستقرة قابلة للتكرار. كدليل على المفهوم ، تم استخدام الجهاز لتعزيز التأثير السام للخلايا ل Verteporfin في زراعة خلايا 2D HeLa بعد التعرض للضوء. كما هو موضح في الشكل ، كانت قيمة GI50 3.1 ميكرومولار لحالة الضوء.

و 13.8 ميكرومولار للحالة المظلمة لذلك ، فإن الزيادة بأكثر من أربعة أضعاف في الكفاءة مقارنة الظروف تؤكد استخدام Verteporfin كمحسس للضوء وإمكانية تطبيق PhotoAct على فحوصات PDT. للتحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل ، تم استخدام جهاز PDT تجاري في ظل نفس الظروف التجريبية ، بما في ذلك المحسس الضوئي والخلايا والطلاقة ، وتمت مقارنة النتائج. كما هو موضح في الشكل ، قام كلا الجهازين بتنشيط Verteporfin ضوئيا بالتساوي ، مما يعزز التأثير السام للخلايا.

أخيرا ، تم تأكيد موت الخلايا بوساطة ROS الناجم عن Verteporfin بعد التعرض للضوء عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مقايسة DCFDA. باختصار ، تم بناء الجهاز بسهولة باستخدام مكونات منخفضة التكلفة متاحة تجاريا بتكلفة إجمالية أقل من 50. تشمل الميزة الرئيسية الأخرى للجهاز قابلية النقل ، وانخفاض الطلب على الصيانة ، والقدرة على تشعيع أنواع متعددة من ألواح الاستزراع ، والاستخدام المتزامن لما يصل إلى أربع وحدات لكل فحص ، والإشعاع الدقيق والقابل للتكرار ، وواجهة الإعداد سهلة الاستخدام والبسيطة التي لا تتطلب الاتصال بأجهزة الكمبيوتر أو الأجهزة الأخرى.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم مخطط تدفق القرار لتوفير نهج منهجي لحل المشكلات للعثور على المشكلات أو الأخطاء وتصحيحها أثناء العملية. تسمح هذه النتائج بتوسيع فوائد PhotoAct لتسهيل PDT للبحث العلمي ، واستكشاف آلية عمل المحسسات الضوئية وتطبيقاتها السريرية.