اختبار الأدوية قبل السريرية في أنسجة العضلات المهندسة 3D القابلة للتطوير

تستخدم منصتنا أنسجة العضلات المهندسة 3D وأجهزة الاستشعار المغناطيسي لقياس الانقباض عبر 24 بئرا في وقت واحد. يوفر هذا طريقة إنتاجية أعلى لتقييم العلاجات الجديدة في المختبر باستخدام أنسجة العضلات البشرية. تعمل طريقة الصب لدينا على تحسين الاتساق والتكاثر في تصنيع أنسجة العضلات المهندسة 3D.

لقد صممنا لوحة صب قابلة للاستهلاك مكونة من 24 بئرا ومجهزة بأجهزة استشعار مغناطيسية لقياسات الانقباض والتحليل على منصتنا. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة قيمة حول نمذجة الأمراض في المختبر ، واكتشاف الأدوية ، والعلاج الجيني لأي مرض عضلي يؤثر على الانقباض. نحن حاليا دمج الخلايا العصبية الحركية في بنياتنا 3D لإنشاء نموذج تقاطع عصبي عضلي كذلك.

للبدء ، ضع مجموعة صب الأنسجة المبردة مسبقا على كتلة باردة أو ثلج داخل غطاء زراعة الخلايا. ضع لوحة الصب بشكل مسطح على الجليد. أضف الثرومبين إلى الوسط الأساسي لعمل محلول الثرومبين وانقل شبكة العمود من لوحة الصب إلى صفيحة معقمة جديدة ذات 24 بئرا.

ماصة 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين في كل بئر مبردة مسبقا من لوحة الصب ووضع الشبكة مرة أخرى على المجموعة. ضع مجموعة الصب جانبا على الثلج. بعد ذلك ، أضف 500 ملليلتر من وسط RPMI ، و 10 ملليلتر من B27 ، و 2.5 جرام من حمض أمينوكابرويك ، أو ACA ، لتحضير وسط EMT القلبي.

أخرج وسيط EMT الذي سيتم استخدامه لصب الأنسجة وإضافة مثبط 10 ميكرومولار ROCK إليه. قم بإعداد وسط EMT الهيكلي بإضافة 50 ملليلتر من وسط F10 و 0.25 جرام من حمض أمينوكابرويك ، أو ACA ، للخلايا العضلية الأولية. استخدم 0.1 جرام من ACA للأرومات العضلية المشتقة من IPSC.

ثم قم بتصفية وسط الصب المعقم الذي يحتوي على ACA. قم بتسخين كاشف تفكك درجة زراعة الخلايا وحجم متساو من EMT متوسط إلى 37 درجة مئوية. سيتم استخدام وسط EMT الدافئ هذا لتخفيف كاشف التفكك.

اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وأضف كاشف التفكك الدافئ لرفع الخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى ترفع الخلايا وتحقق من الثقافات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق عن طريق النقر على جانب اللوحة. بمجرد رفع الخلايا ، انقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.

سحن باستخدام ماصة P-1000 لضمان تعليق خلية واحدة. اغسل اللوحة والقارورة بوسيط EMT إضافي لجمع الخلايا المتبقية وإضافتها إلى الأنبوب المخروطي. مرة أخرى ، قم بمسح الخلايا لضمان تعليق خلية واحدة.

أضف وسيط EMT لإنهاء عملية التفكك ثم خذ عينات من معلقات الخلايا لتعداد الخلايا. قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم باللون الأزرق المثقب. قم بتدوير الخلايا عند 200 جم لمدة أربع دقائق ، ونضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسط الأساسي EMT لإزالة كاشف التفكك المتبقي.

بعد الطرد المركزي مرة أخرى لمدة أربع دقائق ، قم بنضح المادة الطافية وإعداد تعليق الخلية بالكثافة المناسبة. احسب أحجام كل محلول خلوي مطلوب لتكوين العدد المطلوب من الأنسجة وماصة الأحجام المحسوبة للخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين لكل EMT إلى تعليق الخلية وضعه على الجليد.

تأكد من أن كل EMT يحتوي على 90 ميكرولتر من تعليق الخلية ، و 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين ، و 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين في بناء الأنسجة النهائي. في غطاء زراعة الخلايا ، قم بإزالة غطاء مجموعة صب الأنسجة وضع لوحة الصب مع وضع شبكة ما بعد مسطحة على الجليد. امزج خليط الفيبرينوجين الخلوي وارسم 100 ميكرولتر باستخدام ماصة P-200.

أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى الآبار المحضرة ب 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين وسحنها خمس مرات لتخلط جيدا. لا تدفع الماصة إلى ما بعد المحطة الأولى وقم بإزالة الطرف بعد التثليج لتجنب تكوين أي فقاعات. امزج تعليق الخلية في الأنبوب المخروطي قبل صب كل نسيج.

أمسك كلا من الشبكة ولوحة بئر الصب في وقت واحد باستخدام إصبع المؤشر والإبهام بيد واحدة لتجنب أي حركة للشبكة أو اترك اللوحة مسطحة على الجليد وقم بهز دلو الثلج لرؤية لوحة الصب. كرر مع طرف P-200 جديد لكل منديل حتى يتم صب جميع الأنسجة. انقل بعناية المجموعة المصنفة إلى الحاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد صفيحة جديدة من 24 بئرا مع ملليلتر لكل بئر من وسط EMT لأنسجة القلب واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لتدفئة الوسط. بعد الحضانة لمدة 80 دقيقة ، أضف برفق ملليلتر واحد من وسط EMT إلى حافة آبار الصب واحتضانها لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق من الحضانة ، ارفع شبكة ما بعد بعناية وانقل الأنسجة من لوحة الصب إلى صفيحة 24 بئرا معدة مع الوسط الدافئ.

أخيرا ، أعد الألواح التي تحتوي على مناديل إلى حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. يمكن أن يتراوح إنتاج EMT غير الناجح من الإخفاقات الكارثية مثل انفصال الأنسجة عن الوظائف ، إلى عيوب هيكلية أكثر دقة مثل فقاعات الهواء وترسب الأنسجة غير المتكافئ حول كلا الوظيفتين. EMT بناء يوم واحد بعد الصب يظهر هنا.

تم نقل أنسجة العضلات الهيكلية إلى وسط تمايز يبدأ من اليوم صفر من اندماج الخلايا وضغط الهيدروجيل. من اليوم السابع حتى اليوم 28 ، أظهر نفس EMT طولا إجماليا أقصر قليلا بين الوظيفتين وعرضا أصغر عند قياسه من خلال القسم الأوسط من EMT. تم تتبع أربع لوحات من الأنسجة على مدار 21 يوما لمقارنة قطر EMT طوال فترة الضغط.

تظهر النقاط الزمنية حجم EMT متسقا بين اللوحات. يتم الوصول إلى أقصى ضغط في اليوم 21 حيث يتم تثبيت إعادة تشكيل المصفوفة. تم تصوير الكيمياء الهيستولوجية المناعية ل EMTs هنا.

تم إصلاح EMTs في اليوم 10 من الثقافة وجزءا لا يتجزأ من البارافين. تم تلطيخ المقاطع العرضية الرقيقة بالأجسام المضادة ضد سلسلة الميوسين الثقيلة والديستروفين قبل التصوير. تمثل هذه الصور الرسومية متوسط قوة الارتعاش المطلقة المقاسة من EMTs القلبية و EMTs الهيكلية بمرور الوقت.

يظهر هنا علاج دوكسوروبيسين الحاد والمزمن في أنسجة القلب المهندسة. تم إعطاء ثلاثة تركيزات جرعات مختلفة من Dox إما في بلعة أو تم إعطاؤها بشكل مستمر لأنسجة القلب المهندسة على مدار 27 يوما. يتم عرض استجابة الجرعة ل BDM في أنسجة العضلات الهيكلية المهندسة في هذا الشكل.

يتوقف معدل ضربات القلب أو تردد الارتعاش بطريقة تعتمد على الجرعة جنبا إلى جنب مع توقف قوة الانقباض التي تشير إلى السمية القلبية عند تعرض EMTs لهذا المركب. أهم الأشياء التي يجب تذكرها عند صب المناديل هي الحفاظ على كل شيء باردا في جميع الأوقات ، بما في ذلك تعليق الخلية والكواشف والحفاظ على الشبكة اللاحقة ثابتة تماما بمجرد بدء الصب.