استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية
نوفمبر 30, 2022
هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد وتنقية خلايا المبيض من بصيلات الغار. نوضح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع حصاد البصيلات الغارية السليمة التي يتم معالجتها إنزيميا لتحرير أنواع متعددة من الخلايا المقيمة في البصيلات ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، والثيكا ، والبطانة ، المكونة للدم ، والخلايا اللحمية.
يتيح البروتوكول الموضح هنا وضع العلامات وعزل سلالات خلايا معينة موجودة في بصيلات المبيض بدءا من المراحل الغارية المبكرة ، مما يتيح التحليل عالي الدقة والثقافة. يستخدم هذا النهج الدقيق للغاية مجموعات من الأجسام المضادة المترافقة الفلورية لاستهداف علامات سطح الخلية التي يتم التعبير عنها بقوة وعلى وجه التحديد بين سلالات الحبيبية المنفصلة والسدى والثيكا. ابدأ بوضع المبيض في طبق بتري معقم ، واسكب وسطا مبردا معه لترطيب الأنسجة ، مع التأكد من أن المبيض نصف مغمور في الوسط.
إزالة أي خيوط أو مواد أخرى، وتشريح الأنسجة المحيطة المتبقية بعيدا عن المبيض. لعزل البصيلات الغارية ، حدد البصيلات الفردية واختر بصيلات صحية. استبعد أي بصيلات مملوءة بالدم أو داكنة أو غير متماثلة.
عزل الجريبات الغارية المختارة من المبيض باستخدام المشارط ، والحفاظ على الغار سليما واستئصال الأنسجة القشرية التي تشمل المسام. ضع كل جريب غاري سليم تم استئصاله في بئر واحد من صفيحة الآبار الستة. باستخدام مسطرة موضوعة أسفل الطبق ، حدد قطر الجريب لأغراض وصفية.
باستخدام مشرط ، قم بتقسيم الجريب الغاري السليم لتقييم التجويف الغاري وإضافة ستة ملليلتر من وسط انفصال الخلايا الأنزيمية قبل احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف ستة ملليلتر من الوسط المتاح الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني ، أو FBS ، واغسله بالوسط عن طريق السحب القوي المتكرر فوق البصيلات المنقسمة باستخدام ماصة P-1000 الدقيقة. بعد ذلك ، اجمع الوسيط وقم بتمريره عبر مرشح 100 ملم.
بعد الطرد المركزي للطافي المصفى عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل ذلك ، قم باستنشاق المادة الطافية. ضع الأنسجة المتبقية في خليط من 100 وحدة لكل ملليلتر كولاجيناز ووحدة واحدة لكل ملليلتر ديباز مخفف في محلول ملحي متوازن قبل 30 دقيقة من الحضانة. تعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق الثقب والسحب القوي مرتين بعد 10 و 20 دقيقة.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، استرجع الأنسجة واغسلها عن طريق السحب ، من خلال طرف ماصة P-1000 ، وقم بتصفيتها من خلال مرشح 100 ملليلتر. قم بطرد الأنسجة المتوترة عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل وضع حبيبات الخلية المخصبة بخلايا الثيكا وخلايا السدى على الجليد لوضع العلامات و FACS. لتحديد الخلايا الحبيبية وخلايا الثيكا ، أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع يحتوي على أجسام مضادة مقترنة مباشرة واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد غسل الخلايا وطردها مركزيا ، أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 4-6 دياميدينو -2 فينيليندول ، أو DAPI ، وقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال أداة FACS لالتقاط عدد صغير من الخلايا ، باستخدام كثافة الفلورسنت للأجسام المضادة المترافقة الفلوروفور للبوابة. يقسم ما تبقى من المبيض. استئصال النخاع باستخدام مقص ناعم منحني ومشارط ، وتجنب تلف قشرة المبيض.
استمر في معالجة وترقق قشرة المبيض عن طريق الكشط اللطيف حتى يبقى الحد الأدنى من النخاع. قسم الأنسجة القشرية إلى شرائط بعرض ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات على طول المبيض. لتجميد أنسجة المبيض ، ضع شريطا قشريا واحدا في كل قارورة مبردة مبردة تحتوي على محلول التجميد.
هز القوارير المبردة التي تحتوي على الشرائط القشرية على لوحة دوارة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نواة تشكيل بلورات الجليد عن طريق لمس كل قارورة تبريد بطرف قطني مغمور لفترة وجيزة في النيتروجين السائل. تم جمع خلايا المبيض وفرز كسور الخلايا من الجريبات الغارية FACS إلى أكثر من 95٪ نقاء.
تم تصنيف خلايا CD99 الحبيبية المسماة على وجه التحديد في PVRL1 ، أو النيكتين ، بشكل متزايد في حجرة خلايا البويضة الحبيبية مع زيادة حجم الجريبات الغريبة. وقد لوحظ أن الأجسام المضادة ضد endoglin أو CD55 حددت على وجه التحديد جميع خلايا السدى والثيكا وأن ألانين أمينوببتيداز تم التعبير عنه على وجه التحديد بواسطة خلايا الثيكا الأندروجينية. تم تمييز الخلايا بجسم مضاد موجه ضد CD99 لتحديد الخلايا الحبيبية وتم استخدام الأجسام المضادة ضد CD45 لاستبعاد الخلايا المكونة للدم.
فصلت الأجسام المضادة ضد PVRL1 عدد الخلايا الحبيبية إلى مقصورات البويضة والجدارية. بعد الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز ديسباز ، مكنت مستحضرات الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة ضد CD55 و CD34 وألانين أمينوببتيداز من التقاط جميع خلايا السدى أو الثيكا أو خلايا الثيكا الأندروجينية مع استبعاد الخلايا البطانية من مجموعات خلايا ثيكا. توخ الحذر بشكل خاص لتجنب تعطيل غار البصيلات أثناء عزل الجريب الأولي عن طريق القطع داخل هامش آمن حول حدود الجريب.
في نهاية هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا للتحليل الجزيئي أو التشخيصي أو بدلا من ذلك يتم استزراعها في المختبر لدراسات السموم أو التحليل التجريبي أو تلخيص البيئة المكروية للجريب. حتى الآن ، تم استخدام هذه الطرق لنمذجة اضطرابات الغدد الصماء التي تنطوي على المبيض وتحديد مجموعات فرعية جديدة من الخلايا المرتبطة بالجريب.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لتحديد وتنقية الخلايا المبيضية من المسام الأنفية، والتي تعتبر أساسية لفهم بيولوجيا المبيض. وتوضح الطرق لمعالجة المبيضين بأكملهما للحفظ بالتبريد مع تمكين استخراج المسام الأنفية الكاملة المعالجة إنزيميًا لتحرير أنواع مختلفة من الخلايا المقيمة في المسام.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- بيولوجيا الخلية المبيضية
- تقنيات تنقية الخلايا
- تطوير وتحليل المسام
الخلفية
- أهمية تحديد خصائص الخلايا المبيضية
- أهمية المسام الأنفية في الصحة الإنجابية
- الحاجة إلى أساليب دقيقة لعزلة الخلايا
الطرق المستخدمة
- التسمية وعزلة الأنساب الخلوية المحددة باستخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفور
- استخدام المبيضين الفأري كنظام بيولوجي
- تقنيات تشمل FACS لفرز الخلايا، الهضم الأنزيمي، والحفظ بالتبريد
النتائج الرئيسية
- العزل والتسمية الناجحة للخلايا الجرابية، والخلايا الشبكية، وخلايا الطبقة الهلامية من المسام الأنفية
- تبيين نقاو عالية (>95%) للأنواع الخلوية المعزولة
- تحديد علامات محددة لمختلف تجمعات الخلايا، مما يعزز فهم تكوين المسام
الخلاصات
- توضح هذه الدراسة أساليب فعالة لعزل وتوصيف الخلايا المبيضية.
- تحظى النتائج بأهمية في البحوث المتعلقة بالاضطرابات الغدية والنهج العلاجية اللاحقة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution extraction and purification of lineage-specific cells from human antral follicles enables precise interrogation of ovarian biology at early developmental stages. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for reproductive and endocrine research portfolios. Access to viable, well-characterized cell populations enhances predictive confidence in disease modeling and translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables isolation of discrete granulosa, theca, stromal, endothelial, and hematopoietic cell populations for pathway analysis.
- Supports functional validation of ovarian cell markers and mechanistic hypotheses in reproductive biology.
- Facilitates identification of novel subpopulations relevant to endocrine disorder modeling.
Screening & Assay Development
- Provides highly purified cell types for standardized in vitro assays and toxicology studies.
- Enables reproducible preparation of lineage-specific cells for downstream molecular and diagnostic analyses.
- Supports quantitative assessment of cell surface marker expression using fluorophore-conjugated antibodies and FACS.
Translational & Preclinical Research
- Allows recapitulation of the follicle microenvironment in vitro for disease-relevant system modeling.
- Enables continuity from cellular discovery to preclinical validation in ovarian and endocrine research.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate targets by providing robust cellular models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying validated ovarian cell populations for hypothesis testing, assay development, and translational modeling.
- Discovery Biology: Supports high-resolution analysis of follicle growth mechanisms and cell lineage specification.
- Screening: Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell purity and marker expression via FACS and antibody labeling.
- Translational Research: Provides disease-relevant cellular systems for modeling endocrine disorders and ovarian physiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating and characterizing ovarian cell types across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ovarian biology research.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and labeling for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and endocrine research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ovarian tissue handling, enzymatic digestion, and FACS-based cell sorting.
- Demands access to sterile dissection tools, fluorophore-conjugated antibodies, and flow cytometry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell labeling and gating strategies.
- Adaptation may be needed for different follicle sizes or developmental stages.
- Limited by availability of human ovarian tissue and access to early-stage follicles.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Processing the Ovarian Tissue and Isolation of Antral Follicles
1:50
Isolation of Follicle Resident Cells
3:01
Fluorescence-Activated Cell Sorting
3:36
Processing of the Ovarian Cortical Tissue and Ovarian Tissue Slow Freezing
4:24
Results: Identification and Purification of Ovarian Cells from Antral Follicles
5:45
Conclusion
