في المختبر اختيار مثبطات النسخ المهندسة لإسكات الجينات اللاجينية المستهدفة

هنا ، نقدم بروتوكولا للاختيار المختبري لمثبطات النسخ الهندسية (ETRs) ذات كفاءة إسكات عالية وطويلة الأجل ومستقرة وعلى الهدف ونشاط منخفض على مستوى الجينوم وخارج الهدف. يسمح سير العمل هذا بتقليل ذخيرة أولية معقدة من ETRs المرشحة إلى قائمة قصيرة ، مناسبة لمزيد من التقييم في الإعدادات ذات الصلة بالعلاج.

تنتمي تقنية إسكات الجينات اللاجينية التي طورناها إلى ساحة أكبر من التقنيات ، وهي تقنيات إسكات الجينات. قبل أن نبدأ في تطوير الحاجة إلى إسكات الجينات اللاجينية ، كان هناك بديلان مختلفان في هذا المجال. أحدهما هو الضرب الجيني عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي ، والآخر كان تعطيل الجينات بواسطة النيوكليازات الاصطناعية.

وتعطيل الجينات بواسطة النيوكليازات الاصطناعية يعمل على مستوى الحمض النووي. لذلك لديك الجين المستهدف الذي تريد تعطيله ، وتوصل إلى الخلية بعض النيوكليازات الاصطناعية ، والتي تحفز كسر الخيط المزدوج. قد يؤدي هذا النوع من كسر الأوتار المزدوجة إلى المجموع التنحطي ، طفرة إزاحة الإطار ، التي تفرض في النهاية إما تنكس البروتين غير الوظيفي ، أو تدهور النسخ في وقت واحد.

لذا فإن الإسكات اللاجيني يعمل عن طريق توصيل الخلية ، ما يسمى بمثبطات النسخ الهندسية. هذه بعض البروتينات الصغيرة القادرة على الارتباط بالحمض النووي المستهدف ، ثم تفرض فقط على الجين المستهدف ، ما يسمى ماركس اللاجيني. هذه بعض التعديلات الكيميائية ، التي بمجرد ترسبها على الحمض النووي ، يمكن أن تؤدي إلى ضغط الكروماتين.

يؤدي ضغط الكروماتين بشكل مهم إلى تثبيط النسخ ، لذلك لم يعد لديك أي تعبير عن الجين المستهدف. والأهم من ذلك ، أن هذا النوع من حالة النسخ القمعية يمكن أن توحدها الخلايا لفترة طويلة. لتحديد خطوط الخلايا التي تعبر عن الجين المستهدف المراد إسكاته ، تصفح الجين المستهدف في أطلس البروتين البشري ، وانتقل عبر قسم خط الخلية لتحديد خطوط الخلايا الممثلة للنسيج الجسدي محل الاهتمام.

من خطوط الخلايا المحددة ، حدد أولويات تلك التي تتوفر لها بروتوكولات توصيل الجينات العابرة الفعالة. بعد ذلك ، افتح عارض الجينات وحدد منطقة الجين المستهدف لدمج شريط التعبير الفلوروفوري. ثم استخدم CHOPCHOP لتحديد واختيار GNRA ، والتي ستقطع المنطقة المستهدفة في أول إنترون من جين Beta-2M.

بعد ذلك، صمم نموذجا مانحا لموقع قطع GNRA، يتكون من ذراع التماثل الأيسر، وشريط تعبير الجينات المحورة الخالي من المروج، وذراع التماثل الأيمن. قم بتسليم نظام CRISPR Cas9 nuclease وقالب المتبرع داخل خط خلية K-562 من خلال nucleofection ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثقافة خلايا K-562 لمدة 14 يوما على الأقل.

راقب مستويات تعبير مراسل الفلورسنت بمرور الوقت باستخدام مقياس التدفق الخلوي. قم بتنشيط قناة FICO etherin لقياس شدة مضان مراسل tdTomato . تصفح الجين المستهدف في متصفح UCSC Genome Browser واستخرج تسلسل النوكليوتيدات للمناطق ، التي من المحتمل أن تنظم نشاطها النسخي ، مثل جزر CpG والمواقع المخصبة لأستلة H3K27.

الصق التسلسلات المحددة في أداة CHOPCHOP عبر الإنترنت، وحدد القمع كغرض من GNRAs المراد استردادها. ستوفر CHOPCHOP قائمة ب GNRAs التي تم تعيينها على التسلسل الجيني للاهتمام والمدرجة وفقا للدرجة ، مع الأخذ في الاعتبار عدد التطابقات خارج الهدف والكفاءة المتوقعة على الهدف. حدد ما لا يقل عن 10 GNRAs لكل تسلسل هدف.

حاول اختيار GNRAs التي تغطي المنطقة بأكملها ليتم دمجها دون تطابقات كاملة مع التسلسلات الجينية الأخرى في جميع أنحاء الجينوم. بعد تحويل تشفير البلازميدات ل ETRS في خلايا E.coli المختصة كيميائيا ، قم بفحص المستعمرات بحثا عن وجود البلازميد الحامل ل ETR عن طريق تقييد هضم الإنزيم وتسلسل سانجر. لاستنساخ GNRAs داخل العمود الفقري ل phU6 GNRA ، أولا ، قم بإنشاء oligos باستخدام برنامج تصميم البيولوجيا الجزيئية.

ألحق تسلسل خمسة نيوكليوتيدات في أعلى منبع فاصل البروتو وقم بتسمية هذا القلة الطويلة المكونة من 25 نيوكليوتيد. وبالمثل ، قم بإلحاق تسلسل خمسة نيوكليوتيدات من المكمل العكسي لفاصل البروتو والسيتوزين في اتجاه مجرى النهر منه ، لتوليد أوليجو طويل من 25 نيوكليوتيد وتسميته. احصل على هذه oligos توليفها على شكل oligos DNA مفردة خالية من الملح معاد تعليقها في الماء عند 100 ميكرومولار.

أضف ميكرولتر واحد من كل oligo إلى ميكرولتر من مخزن التلدين و 16 ميكرولتر من الماء. قم بإجراء تلدين oligo عن طريق وضع المحلول في جهاز تدوير حراري عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تبرد تدريجيا إلى 25 درجة مئوية خلال 45 دقيقة.

تمييع ميكرولتر واحد من oligos الملدن مع 99 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. ثم اربط ميكرولتر واحد من هذا التخفيف ب 50 نانوجرام من بلازميد phU6 GNRA ، الذي تم هضمه مسبقا باستخدام إنزيم تقييد Bsa1. تحويل 20 ميكرولتر من خلايا E.coli المختصة كيميائيا مع اثنين ميكرولتر من منتج الربط.

اختر مستعمرات متعددة لإنتاج الحمض النووي للبلازميد وتأكد من الاستنساخ الناجح لفاصل البروتو عن طريق تسلسل سانجر. لتسليم GNRAs و CRISPR dCas9 DTRs في خط خلية المراسل في صفيف ، أولا ، قم بإعداد أنابيب منفصلة تحتوي على 500 نانوجرام من كل بلازميدات ، وإضافة 125 نانوجرام من بلازميدات تشفير GNRA المختلفة ليتم اختبارها. قم بتضمين حالة النواة الخالية من GNRA و ETR كعينة معالجة وهمية.

قم بإعداد ثلاث نسخ مكررة فنية على الأقل لكل عينة. بيليه خمس مرات 10 إلى خلايا بيتا 2M tdTomato K-562 الخامسة لكل أنبوب ، و nucleoffect لهم مع مزيج البلازميد. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائط زراعة خلايا الثدييات RPMI 1640 التي تم تسخينها مسبقا ووضعها في الحاضنة.

استخدم قياس التدفق الخلوي لقياس النسبة المئوية للخلايا الصامتة في نقاط زمنية مختلفة بعد تسليم ETRs. استخدم خلايا من النوع البري بدون تسلسل طلاء Flora 4. لتعيين عتبة الخلايا السلبية للمراسل.

استخدم العينة المعالجة الوهمية لتعيين البوابة للخلايا الإيجابية للمراسل. تحديد أهم ثلاث وكالات GNRA من حيث كفاءة إسكات الأصوات على المدى الطويل. استخدم الحقائق لاختيار المجموعات السكانية الفرعية السلبية للمراسل التي يتم الاحتفاظ بها بثبات في تلك العينات.

قم أيضا بإجراء حقائق عن العينات المعالجة الوهمية تحت نفس المعاملة للسماح بإجراء مقارنة مناسبة في التحليلات اللاحقة. تم دمج مراسل الفلورسنت tdTomato في أول إنترون لجين بيتا 2M البشري بواسطة الإصلاح الموجه للطموم الناجم عن كريسبر كاس 9. تظهر خلايا K-562 الإيجابية للمراسل في العينة المعالجة بعد التكامل.

عند التسليم العابر لمجموعة ETR الثلاثية ، جنبا إلى جنب مع GNRAs ، تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي الطولي لتقييم تعبير المراسل الفلوري. لوحظت ذروة في قمع المراسلين في التحليلات الحادة ، والتي أعيد امتصاصها جزئيا بسبب التخفيف الانقسامي للبلازميدات المشفرة ETR بمرور الوقت. كان الترسب الفعال لمثيلة CpG على الموقع المستهدف من خلال تركيبة GNRA التابعة ل ETR واضحا من خلال القمع الدائم للمراسل في جزء كبير من الخلايا المعالجة.

وأظهرت مختلف الهيئات الوطنية لتنظيم الموارد الطبيعية (GNRA) كفاءة متفاوتة في إسكات الأجل. واحدة من أهم الخطوات في تحقيق إسكات دائم وفعال للإيبيجينوم هي تحديد الحمض النووي الريبي المفرد الفعال. للقيام بذلك ، أي نوع من التطبيقات ، يجب أن تبدأ بتحديد التسلسلات الأكثر استجابة ، بما في ذلك المروج والإجابة في أي مواقع أخرى لمنظمي النسخ.

بمجرد تحديد المنطقة التي يمكن أن تكون المنطقة الأكثر استجابة وفعالية ، يجب على أي شخص تصميم نوع مختلف من اختبار gRNA الفردي كفرد أو مزيج من gRNA واحد. أحد التطبيقات الأكثر وضوحا لتحرير epigenome هو بالتأكيد الترجمة قبل السريرية في أي مكسب للطفرة الوظيفية ، حيث يمكن أن يكون إسكات هذا الجين مفيدا لعلاج أمراض معينة. بدلا من ذلك ، يجب أن نضع في اعتبارنا على أي حال أن القدرة على تغيير التنظيم اللاجيني على وجه التحديد لمروج معين يمكن أن تكون أدوات مفيدة للغاية لكل من العلوم السريرية والأساسية الانتقالية.