التقارب الخلوي للمستحلب المستقر للجسيمات لتعزيز استيعاب المستضد
سبتمبر 2, 2022
لتصميم مواد مساعدة فعالة بشكل عقلاني ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) من حمض اللاكتيك والجليكوليك. يمتلك PNPE نعومة فريدة وواجهة كارهة للماء للاتصال الخلوي القوي وقدم تحميلا عالي المحتوى للمستضد ، مما أدى إلى تحسين التقارب الخلوي لنظام التوصيل إلى الخلايا المقدمة للمستضد وإحداث استيعاب فعال للمستضدات.
قمنا بتطوير الجسيمات النانوية PLGA استقرت مستحلب بيكرينغ. قام مستحلب بيكرينغ بتحسين التقارب الخلوي لخلايا بروتين المستضد ، مما أدى إلى استيعاب المستضدات بكفاءة. كانت مستحلبات بيكرينغ المستقرة بالجسيمات النانوية سهلة التحضير وتوصيل المستضد بكفاءة.
بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام طريقة لمراقبة تقارب المستحلب مع الخلية وتوضيح الاستيعاب. يوفر هذا البروتوكول رؤى لتصميم تركيبات جديدة ذات كفاءة عالية للخلايا واستيعاب فعال للمستضد ، مما يوفر منصة لتطوير لقاحات فعالة. للبدء ، أضف 100 ملليغرام من حمض polylactic-co-glycolic إلى 10 ملليلتر من خليط الأسيتون والإيثانول بنسبة أربعة إلى واحد لتكون بمثابة مرحلة الزيت.
ضع 20 ملليلتر من محلول PVA المائي تحت غطاء الدخان وحركه مغناطيسيا بمعدل 400 دورة في الدقيقة. أضف خمسة ملليلتر من مرحلة الزيت إلى محلول PVA قطرة قطرة باستخدام مضخة حقنة. ثم حرك الخليط في غطاء الدخان حتى تتبخر المذيبات العضوية تماما.
بعد تطاير المذيبات العضوية ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 15،000 G.اغسل ثلاث مرات أو أكثر حتى يصبح ماء الغسيل النهائي واضحا وشفافا. أعد تعليق جسيمات PLGA النانوية المغسولة في ملليلتر من الماء منزوع الأيونات وقم بتجميد الخليط عند 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لتوصيف حجم وإمكانات زيتا لجسيمات PLGA النانوية ، أضف 10 ميكرولتر من جسيمات PLGA النانوية إلى ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول مخفف ونقل المحلول المخفف إلى خلية DTS1070.
قم بتشغيل الكمبيوتر ومحلل تشتت الضوء الديناميكي. ثم ضع خلية DTS1070 في نظام DLS. انقر فوق برنامج Zetasizer وقم بإنشاء ملف قياس جديد لإعداد إجراء التحديد.
ثم ابدأ إجراء التحديد للحصول على حجم الجسيمات وتوزيع زيتا المحتمل. لتحضير جسيمات PLGA النانوية المستقرة مستحلب بيكرينغ ، أو PNPE ، أضف جسيمات PLGA النانوية المجففة بالتجميد إلى الماء منزوع الأيونات بتركيز أربعة ملليغرام لكل ملليلتر ثم أضف السكوالين كطور زيت. إعداد PNPE عن طريق صوتنة خطوة واحدة لمدة خمس دقائق في 100 واط في سونيكاتور حمام مائي.
تمييع 20 ميكرولتر من PNPE ومليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات. إسقاط 20 ميكرولتر من المستحلب على الشريحة. مراقبة مورفولوجيا وتجانس المستحلب باستخدام المجهر الضوئي عند تكبير 40 مرة والحصول على صور فوتوغرافية.
قم بتشغيل طبقة الدوران بالضغط على زر الطاقة. اضغط على زر التحكم واضبط وقت الطلاء وسرعته. قم بتوصيل أنبوب النيتروجين بطبقة الدوران واضبط تجزئة أسطوانة الغاز على 0.4 كيلو باسكال.
ضع الرقاقة النظيفة على كوب الشفط الخاص بطبقة الدوران. أضف 100 ميكرولتر من بولي-ل-ليسين قطرة قطرة إلى مركز مستشعر ثاني أكسيد السيليكون وأغلق الغطاء العلوي لطلاء الدوران. اضغط على زر البدء لبدء طلاء العينة وإيقاف الجهاز عند الانتهاء.
قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ، وأوقف تشغيل أزرار الطاقة والتحكم ، وقم بإزالة مستشعر ثاني أكسيد السيليكون المعدل poly-l-lysine. لتحديد التصاق الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ب PNPE ، قم بتشغيل الكمبيوتر والوحدة الإلكترونية والمضخة التمعجية ، وقم بتنشيط التحكم في درجة الحرارة في أسفل اليمين في البرنامج للتأكد من أن درجة الحرارة المحددة أقل بحوالي درجة مئوية واحدة تحت درجة حرارة الغرفة. ضع مستشعرات ثاني أكسيد السيليكون المعدلة poly-l-lysine في خلية التدفق وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيل خط القياس بين خلية التدفق ومضخة التدفق.
ضع خلية التدفق داخل نظام وحدة التدفق. انقر فوق شريط أدوات الاستحواذ وحدد إعداد القياس للبحث عن 1 و 3 و 5 و 7 و 9 و 11 أوكتاف من الشريحة في القناة المستخدمة. لتصحيح خط الأساس ، انقر فوق بدء القياس للسماح للهواء بالدخول إلى وحدة التدفق حتى يصبح خط الأساس للهواء سلسا.
بعد تدفق الماء منزوع الأيونات لمدة 10 إلى 15 دقيقة لتمكين توازن خط الأساس للمحلول مرة أخرى ، قم بضخ محلول PNPE المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق 50 ميكرولتر في الدقيقة لتحقيق امتصاص التوازن على مستشعر ثاني أكسيد السيليكون. قم بضخ محلول الحويصلة خارج الخلية المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق يبلغ 50 ميكرولتر في الدقيقة لتتبع عملية التصاق bEV بسطح PNPE. احتضان الخلايا المتغصنة لنخاع العظم ب 1640 وسائط كاملة لمدة سبعة أيام ثم بذرها في أطباق ليزر صغيرة متحدة البؤر بمعدل 1 مرة 10 إلى 6 لكل بئر طوال الليل عند 37 درجة مئوية وحاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
امزج 0.5 ملليلتر من السيانين 5 المسمى بالبويضات ، مع 0.5 ملليلتر من PNPE لمدة ساعة واحدة وقم بإزالة المستضد السائل عن طريق الطرد المركزي عند 5،000 جم لمدة 20 دقيقة لتطوير تركيبة اللقاح. بعد إعادة التعليق باستخدام 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، أضف 10 ميكرولتر من التركيبة إلى أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر تحت مقعد نظيف للغاية وشارك في الزراعة مع الخلايا المتغصنة لنخاع العظم لمدة ست ساعات. بعد إزالة سائل الثقافة من الخلايا ، اغسلها مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات مسبقا.
إصلاح الخلايا مع محلول الفورمالديهايد 4 ٪ و PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين أو ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منهما. تغلغل الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول Triton X-100 بنسبة 0.5٪ لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS ، قم بتغطية الخلايا الموجودة على الطبق السفلي الزجاجي لأطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر ب 200 ميكرولتر من محلول عمل الفلوريسئين إيزوثيوسيانات المترافق مع القضيب واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ، أعد تثبيت النوى ب 200 ميكرولتر من محلول DAPI لمدة 30 ثانية تقريبا. لتحليل الصور ، قم بتشغيل أجهزة المجهر متحد البؤر بالتسلسل بما في ذلك الليزر والبؤرة والمجهر والكمبيوتر.
انقر فوق البرنامج وحدد Nikon Confocal للدخول إلى نظام الاختبار. في نظام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل الوحدات المختلفة بالترتيب المشار إليه. أولا ، قم بإعداد قنوات FITC و DAPI و Cy5 واضبط HV والإزاحة المقابلة.
ثم بعد اختيار عدسة الزيت 100 مرة ووضع قطرة من زيت الأرز في الأعلى ، ضع أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر التي تحتوي على خلايا تغصنية ملطخة بنخاع العظم على مرحلة المجهر. انقر فوق زر المسح الضوئي. تحت المجهر الفلوري ، حدد موقع الخلايا ذات الأهمية عن طريق تحريك المحور السيني والمحور ص والمحور z.
اضبط شدة الليزر وحجم الصورة والمعلمات الأخرى لتمكين مسح الصور متحدة البؤر عالية الجودة. أخيرا ، انقر فوق الزر "التقاط" واحفظ الصور. تم تتبع التصاق الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ب PNPE باستخدام QCM-D.
انخفاض فوري في التردد ، أشار إلى التصاق سريع للحويصلات خارج الخلية المحاكاة الحيوية إلى PNPE بعد اللقاء. علاوة على ذلك ، انخفض دلتا F مع زيادة تركيز الحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ، مما يعكس تأثيرا يعتمد على التركيز. كانت الجسيمات الدقيقة PLGA ومستحلب النانو المستقر بالسطحي مرتبطة بشكل ضعيف بالحويصلات خارج الخلية المحاكية بيولوجيا ، حتى عند التركيز العالي البالغ 80 ميكروغرام لكل ملليلتر ، والذي ربما نتج عن نقص مواقع الاتصال بالخلايا المناعية.
أشارت إشارة الفلورسنت السيانين -5 البيضاوي إلى أن الكمية الإجمالية للمستضد المستنفد المستوعب في الخلايا أعلى بكثير في المجموعة المعالجة ب PNPE مقارنة بتلك الموجودة في الجسيمات الدقيقة PLGA والمجموعة المعالجة بمستحلب النانو المستقر بالسطح. أظهر التحليل الكمي للامتصاص الخلوي كثافة نسبية أعلى بكثير من الخلايا المرابطة الفلورية ونخاع العظم المعالجة ب PNPE مقارنة بتلك المعالجة بالجسيمات الدقيقة PLGA ومستحلب النانو المستقر بالسطح. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أن PNPE عزز استيعاب المستضد وقدم المستضد بشكل فعال داخل الخلايا.
من أجل الحصول على مستحلب متجانس ، يجب أن يهتز الخليط باستمرار أثناء الصوتنة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بنانو جزيئات حمض البولي لاكتيك والجليكوليك المشترك (PNPE) لتسليم المستضد بكفاءة. PNPE يعزز التقارب الخلوي ويعزز إدخال المستضدات، مما يوفر منصة واعدة لتطوير اللقاح.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التكنولوجيا الحيوية
- علم المناعة
- تطوير اللقاح
الخلفية
- أنظمة تسليم المستضدات ضرورية للقاحات الفعالة.
- يمكن لمستحلب بيكرينغ تثبيت النانو جزيئات لأداء أفضل.
- تحسين التقارب الخلوي ضروري لإدخال المستضدات.
- تقدم نانو جزيئات PLGA خيارًا قابلًا للتحلل الحيوي لتسليم الدواء.
هدف الدراسة
- لتصميم مادٍ مساعد فعال باستخدام PNPE.
- لتعزيز التقارب الخلوي لأنظمة تسليم المستضدات.
- لإحداث إدخال فعال للمستضدات في الخلايا المقدمة للمستضدات.
الطرق المستخدمة
- تحضير نانو جزيئات PLGA في خليط مذيب.
- تثبيت مستحلب بيكرينغ بنانو جزيئات.
- مراقبة التقارب الخلوي وإدخال المستضدات.
- تقييم كفاءة نظام التسليم.
النتائج الرئيسية
- أظهر PNPE تقاربًا خلويًا محسّنًا للخلايا المقدمة للمستضدات.
- تحقق إدخال فعال للمستضدات.
- كانت طريقة تحضير PNPE بسيطة ويمكن تكرارها.
- يوفر هذا النهج أساسًا لتطوير لقاحات فعالة.
الاستنتاجات
- PNPE هي منصة واعدة لتسليم المستضدات.
- يمكن أن يؤدي التقارب الخلوي المحسن إلى فعالية أفضل للقاح.
- تساهم هذه الدراسة في تصميم صيغ جديدة للتحصين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Enhancing cellular affinity and antigen internalization is a critical inflection point in vaccine and immunotherapy discovery pipelines. The PLGA nanoparticle-stabilized Pickering emulsion (PNPE) platform enables real-time quantification of cell-emulsion interactions and supports predictive confidence in antigen delivery system design. This approach directly impacts early-stage formulation triage and portfolio prioritization for next-generation vaccine candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of particle-cell affinity using QCM-D for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of antigen delivery vehicles by measuring real-time adhesion and uptake.
- Facilitates predictive evaluation of formulation parameters impacting immune cell engagement.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for preparing and characterizing nanoparticle-stabilized emulsions.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of antigen uptake via confocal microscopy.
- Enables comparative benchmarking of novel formulations against established adjuvants and particles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cellular affinity and uptake data with preclinical immunogenicity endpoints.
- Supports risk-adjusted advancement of vaccine candidates with enhanced delivery profiles.
- Offers a platform for iterative optimization of antigen-carrier systems prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The PNPE workflow bridges early discovery, screening, and preclinical evaluation by providing a scalable, quantitative platform for antigen delivery system assessment.
- Discovery Biology: Quantifies cell-surface adhesion and internalization to inform target validation and mechanistic understanding.
- Screening: Standardizes emulsion preparation and uptake assays for high-confidence formulation comparison.
- Analytics: Integrates QCM-D and confocal microscopy outputs for robust, quantitative decision-making.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro affinity data to preclinical immunogenicity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse antigen and carrier combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antigen delivery and immune cell targeting.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols for formulation and uptake assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for vaccine candidate advancement and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of delivery platforms with superior cellular affinity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation and surface characterization.
- Needs access to QCM-D instrumentation and confocal microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of emulsion preparation and uptake protocols.
- Adaptation may be needed for different antigen types or immune cell models.
- Homogeneity and reproducibility of emulsions must be maintained for reliable data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparation and Characterization of PLGA Nanoparticles
2:38
Preparation and Characterization of PNPE
3:24
bEVs Adhere to the PNPE
5:31
CLSM Analysis of Antigen Uptake
8:14
Results: Affinity of PNPE to bEVs and Uptake of Antigens
9:41
Conclusion
