Name: التشريح المجهري لعين القوارض (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: تعلم تقنية التشريح المجهري لعين القوارض باستخدام الغشاء الرافع الثالث لتحسين الوصول إلى الأجزاء الداخلية وتقليل تلف الأنسجة. هذه الطريقة تُمكّن الباحثين من عزل طبقات الشبكية بدقة أعلى.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

قام الدكتور ألاكناندا ميشرا ، قسم بيولوجيا الخلية والتشريح البشري ، جامعة كاليفورنيا ديفيس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، بتدريبنا على هذه الطريقة في المعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. وقد دعم هذا العمل بالمنحة الأساسية التي تلقاها من إدارة التكنولوجيا الأحيائية بحكومة الهند إلى المعهد الوطني لعلم المناعة في نيودلهي. تم منح PS زمالة بحثية من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية.

تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. الرقم المرجعي التسلسلي للموافقة هو IAEC # 480/18. تم إجراء التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التنظيمية للجنة الرقابة والإشراف على التجارب على الحيوانات ، وزارة مصايد الأسماك وتربية الحيوانات ومنتجات الألبان ، حكومة الهند ، تحت إشراف طبيب بيطري محترف في SAF ، NII.
1. التحضير
<ol><li>تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين في كل عين. ضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل الإجراء. ملاحظة: لا يلزم وجود مسكن حيث يتم القتل الرحيم للحيوان فور الانتهاء من 30 دقيقة. يسمح التكيف المظلم وتوسيع عيون الحيوان للمراقب بالتحقق من دموع العين والأضرار قبل العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يكون التمدد مفيدا أثناء العمل مع أنسجة مقلة العين المصطبغة.</li>
	<li>القتل الرحيم للحيوان عن طريق إعطاء جرعة 5x من التخدير داخل الصفاق. الجرعة النموذجية هي 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 10 ملغ من الكيتامين و 1 ملغ من الزيلازين. ملاحظة: جرعة القتل الرحيم للحيوان هي الكيتامين عند 400-500 ملغم / كغم من وزن الجسم والزيلازين عند 50 ملغم / كغم من وزن الجسم يعطى داخل الصفاق. بالنسبة للفأر النموذجي الذي يزن 20 جم ، ستكون الجرعة 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10 ملغ من الكيتامين (100 ميكرولتر من محلول مخزون 100 ملغ / مل من الكيتامين) و 1 ملغ من الزيلازين (100 ميكرولتر من محلول مخزون من 10 ملغ / مل زيلازين).</li>
	<li>تأكد من عدم الاستجابة الكاملة للحافز من خلال فحص منعكس الدواسة. عدم وجود نبضات القلب والتنفس هي أيضا مؤشرات مهمة.</li>
	<li>ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين.</li>
	<li>قم بإعداد ملقط خياطة كوليبري ، والملقط المنحني ، وشفرة دقيقة (بحجم 15 درجة ، 3 مم) ، ومقص زنبركي صغير ، ومقص صغير زنبركي بزاوية جاهز للإجراء.</li>
</ol>2. استئصال عين الفأر مع الجفن الثالث
<ol><li>ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين. افتح الجفون الخارجية بالملقط لتصور الجفن الثالث على النحو الأمثل. ملاحظة: يقع الجفن الثالث ، المعروف أيضا باسم الغشاء النخاعي ، باتجاه الزاوية العليا من الظل الأنفي (الشكل 1 أ).</li>
	<li>حدد الجفن الثالث على أنه نتوء شفاف طفيف مع حدود مصطبغة (الشكل 1 ب).</li>
	<li>ضع ملقط منحني حول مقلة العين ، واضغط لتحرير العين من المرفقات الدخيلة. هذا سوف يقلل من النزيف في العين من الأنسجة المحيطة.</li>
	<li>استبدل الملقط المنحني بمقص زنبركي دقيق ، واقطع حول مقلة العين مع الجفن الثالث المتصل به. استخدم جروحا صغيرة مستمرة لتحرير مقلة العين من مرفقات الأنسجة المحيطة.</li>
	<li>ضع مقصا صغيرا زنبركيا منحنيا تحت مقلة العين لتحرير العين عن طريق قطع العصب البصري. تأكد من تحرير مقلة العين بالكامل من محجر العين.</li>
</ol>3. تطهير الأنسجة الدخيلة
<ol><li>ضع العين المنزوعة النواة من الفأر الرحيم في طبق بتري مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4 ، مع ملء طبق بتري بحيث يتم غمر مقلة العين في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>شل حركة مقلة العين المنزوعة النواة للفأر بالجفن الثالث المرفق بيد واحدة باستخدام الملقط.</li>
	<li>مقلة العين في وسط سائل للسماح بمعالجة أكثر كفاءة. ستبدأ بعض العضلات أو الأنسجة خارج العين في الطفو بعيدا عن مقلة العين. قم بإزالتها عن طريق قطعها عن مقلة العين باستخدام مقص زنبركي صغير.</li>
	<li>قم بقص وإزالة العصب البصري من قاعدة مقلة العين باستخدام مقص دقيق للسماح بفصل أفضل للشبكية للاستعدادات الكاملة. ملاحظة: ليس من الضروري إزالة العصب البصري لتقسيم الأنسجة.</li>
	<li>اغسل مقلة العين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة لا تقل عن 2 ساعة عند 4 درجات مئوية لتثبيت الأنسجة. ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء مؤقتا في هذه الخطوة عن طريق ترك الأنسجة في PFA لمدة تصل إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، لعزل الخلايا الحية ، لا ينبغي تنفيذ خطوات التثبيت ، ويجب تنفيذ الإجراء بأكمله دون توقف.</li>
</ol>4. تشريح العين المنزوعة النواة للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية
<ol><li>بعد تثبيت PFA (في حالة جمع الخلايا الحية ، تابع دون تثبيت مقلة العين) ، انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على PBS ، وضعه تحت مجهر تشريح لتنفيذ الإجراء اللاحق.</li>
	<li>شل حركة مقلة العين عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث بإحكام باستخدام ملقط كوليبري للخياطة.</li>
	<li>قم بعمل شق صغير في الحافة عن طريق ثقبه باستخدام شفرة صغيرة. الحافة هي تقاطع القرنية الصلبوية. اجعل الشق مفضلا عن الجفن الثالث ، مما يجعل نقطة وصول للمقص الصغير الربيعي. ملاحظة: قد يوفر استخدام شفرة صغيرة بحجم 15 درجة و 3 مم تحكما أفضل في عمق هذا الشق.</li>
	<li>بعد ذلك ، باستخدام هذا الشق كنقطة انطلاق ، مع زوج من المقصات الدقيقة ، قم بعمل جروح صغيرة ومستمرة على طول محيط طرف القرنية الصلبة. أولا ، أكمل نصف دائرة من الجروح بدءا من نقطة الشق إلى الجفن الثالث. ثم أكمل نصف دائرة القطع المتبقية على الجانب الآخر. أخيرا ، قم بعمل قطع حول الجفن الثالث لفصل الكأس الخلفي والكأس الأمامي. ملاحظة: اعتمادا على فنجان العين محل الاهتمام ، يمكن ترك الغشاء النيكتيتي متصلا إما بفنجان العين الأمامي أو الخلفي.</li>
	<li>قم بإزالة العدسة من الكأس الخلفي باستخدام الملقط للحصول على الكأس الخلفي الذي يتكون من طبقات الشبكية العصبية وظهارة الشبكية الصبغية (RPE). وبالتالي ، يتم فصل العدسة والكأس الخلفي والكوب الأمامي للعين. ملاحظة: في حالة العمل مع الأنسجة غير الثابتة ، يمكن الآن هضم الكؤوس الأمامية والخلفية إنزيميا للحصول على تعليق القرنية أو الشبكية أحادي الخلية.</li>
	<li>لتثبيت الأنسجة ، انقل هذه الأكواب إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: بعد التثبيت ، يمكن تضمين الأنسجة في وسط مناسب ، ويمكن إجراء التقسيم بالتبريد أو تقسيم البارافين للحصول على أقسام القرنية أو الشبكية.</li>
</ol>5. عزل الشبكية العصبية وطبقات RPE
<ol><li>أعد إدخال الكوب الخلفي في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS لغمر الأنسجة.</li>
	<li>تحقق من وجود شبكية العين العصبية. يمكن تصور ذلك كطبقة معتمة على طبقة RPE المصطبغة ، والتي يتم توصيلها عند المحيط المحيطي للكوب.</li>
	<li>امسك الجفن الثالث بالملقط لشل حركة الكأس الخلفي ، وانزع الشبكية العصبية بدءا من المحيط باستخدام زوج ثان من الملقط. ملاحظة: يوصى بشدة بحركات اليد اللطيفة والطفيفة جدا حتى لا تتلف الأنسجة. عند مخرج العصب البصري، يمكن إدخال مقص الزنبرك المنحني تحت الشبكية العصبية، ويمكن إجراء قطع لتحرير الطبقات تماما إذا ظلت الشبكية العصبية متصلة كما هو موضح في الشكل 3. اختياريا ، حرر أو افصل شبكية العين بضربات لطيفة باستخدام فرشاة ناعمة. ومع ذلك ، لن يكون من المناسب القيام بذلك إذا تم جمع شبكية العين من أجل الأنسجة. ملاحظة: يتم الحصول على شبكية العين العصبية وطبقة RPE المصطبغة مع الجفن الثالث.</li>
</ol>6. تجزئة طبقات الشبكية و RPE للتركيب الكامل
<ol><li>أعد إدخال الكؤوس الأمامية والخلفية في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن PBS المؤقت ، وضع الطبق تحت مجهر التشريح.</li>
	<li>شل حركة الكوب الأمامي عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث.</li>
	<li>استخدم مقصا صغيرا بزاوية زنبركية لعمل قطع يبلغ حوالي 3/4 قطر فنجان العين بجوار الجفن الثالث ، مع القطع من المحيط بشكل عمودي باتجاه المركز البصري.</li>
	<li>حافظ على قبضة على الجفن الثالث ، وقم بعمل قطع بجانب القطع الأول.</li>
	<li>قم بعمل قطع مماثل بين القطع الثاني والجفن الثالث. ملاحظة: ثلاث أو أربع قطع متساوية البعد تفتح الأكواب نصف الكروية على شكل زهرة ، والتي تسقط بشكل مسطح ويمكن تركيبها بسهولة.</li>
	<li>شل حركة الكوب الخلفي عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث.</li>
	<li>اتبع نفس الخطوات المعطاة لإجراء التخفيضات (الخطوات 6.3-6.5) على الكوب الأمامي لإجراء ثلاث أو أربع جروح متساوية البعد على الكوب الخلفي. ملاحظة: بالنسبة لأنسجة الشبكية العصبية المعزولة في الخطوة 5 ، قم بإجراء جروح مماثلة للتأكد من سقوطها على السطح. لا تقم بعمل جروح عميقة جدا في وسط الكوب ، لأن ذلك قد يجعل أقسام الأوراق تتفتت أو تنفصل بسهولة.</li>
	<li>أداء تلطيخ ، وتركيب الأنسجة بالكامل لتصور فعال7،8. ملاحظة: يعمل وجود الغشاء النخاعي كمؤشر مادي ثابت للجانب الأنفي من فنجان العين في حوامل كاملة. يساعد على ترسيم الجانب الظهري / البطني من فنجان العين ، حيث يشير الجفن الثالث لفنجان العين إلى الاتجاه الأنفي / البطني.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم العثور على تشريح العين المجهري لتكون مهمة صعبة بسبب صغر حجم وشكل كروية لعين القوارض ، وتتطلب عين القوارض تقنيات مبتكرة للتعامل الفعال8. 
في الطريقة الموضحة الحالية ، يتم الحصول على مقلة عين الفأر المنزوعة النواة مع الجفن الثالث المتصل للتعامل الفعال والسهل. باستخدام الجفن الثالث ، يمكن تجميد مقلة العين تماما ، مما يسمح للتشريح بالمضي قدما بسهولة وبأقل قدر من الأخطاء. علاوة على ذلك ، فإن وجود الجفن الثالث يحدد اتجاه الأجزاء الفرعية للعين. وبالتالي ، يتم تشريح مقلة الع...

تشريح العين هو تقنية مهمة في أبحاث العيون وقد سمح للباحثين بالوصول إلى أجزاء العين للدراسات المستهدفة. في السابق ، اعتمد باحثو العين على أنسجة العين من الأفراد المرضى في دراساتهم. ومع ذلك ، فإن العدد المتزايد تدريجيا من سلالات نماذج القوارض العينية1 على مر السنين قد قلل من الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. سمحت سلالات الفئران هذه بفهم أعمق لأمراض العين والتدخلات. ومع ذلك ، فقد ولدوا أيضا الحاجة إلى تقنيات مبتكرة للتشريح الدقيق للعين. الحجم الصغير ومساحة التشغيل المحدودة يعيقان بشدة الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين. علاوة على ذلك ، نظرا للتجميع الخلوي المتجانس لأكواب العين الخلفية والأمامية ، من الصعب إجراء تدخلات مستهدفة بعد التسلخ. تقنيات التشريح المجهري الحالية لليزر2 والتشريح المجهري الجراحي 3,4 غير كافية لتلبية متطلبات أبحاث العين. التشريح الدقيق بالليزر فعال جدا في تحليل الخلية الواحدة ، ولكن يجب تشريح الأنسجة المحددة قبل إجراء الليزر2. يمكن لهذه التقنية عزل المناطق الصغيرة ذات الأهمية من الأنسجة التي تم تشريحها مسبقا للتحليل الجزيئي. وبالتالي ، فإن هذه التقنية ليست مناسبة لإعداد حوامل كاملة أو لعزل طبقات العين المعبأة محوريا من أجل التصور الأمثل.
الطريقة الجراحية هي التقنية الأكثر استخداما. تتضمن هذه الطريقة شل حركة العين عبر العصب البصري5 ثم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بأي نسيج هش ، حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة لعزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند التشريح.
أثناء التشريح ، فإن الحفاظ على وجود الغشاء المرفق أو الجفن الثالث (الشكل 1) يقدم مزايا فريدة ومهمة. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم استئصال مقلة العين بالجفن الثالث. ثم ، يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين6 (الشكل 2 أ). يتبع ذلك ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية واستخدام الشق كنقطة دخول (الشكل 2B ، C). بعد ذلك ، يتم فصل النظارات عن طريق قطع على طول المحيط الأمامي والخلفي (الشكل 2D-G). من خلال تشريح فنجان العين الخلفي بشكل أكبر ، يمكن تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. ثم يتم إجراء ثلاث أو أربع قطع متساوية البعد في الكؤوس الأمامية والخلفية نصف الكروية التي تم الحصول عليها ، والتي تسمح لهذه الأكواب على شكل زهرة بالسقوط بشكل مسطح على شريحة (الشكل 2H).
يساعد الجفن الثالث في التعامل السهل والفعال أثناء التشريح ، وبالتالي ضمان الحد الأدنى من الضرر للأنسجة أثناء الوصول إلى طبقات العين المختلفة وعند إنتاج حوامل كاملة. علاوة على ذلك ، يساعد وجود الجفن الثالث في تحديد وفحص التدخلات الموضعية أثناء التصور.
تم إجراء الإجراء ، في مختبرنا ، على سلالة فأر CBA / J أو rd1 في P28 من أي جنس. يمكن إجراء الإجراء على أي سلالة أو عمر أو جنس وليس له تحيز وفقا لهذه الخصائص.
تم شراء الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) وصيانتها في مرفق الحيوانات الصغيرة (SAF) في المعهد الوطني لعلم المناعة (NII). تم احتجازهم في أقفاص فردية جيدة التهوية (IVC) وحصلوا على إمكانية الوصول إلى الماء والغذاء المعقم المحمض. تم الحفاظ عليها عند 21-23 درجة مئوية ومع دورة ضوء / مظلمة 14 ساعة / 10 ساعات.
فيما يلي طريقة جراحية معدلة للتشريح الدقيق لعين الفأر.

<table><tbody><tr><td>أسيتامينوفين (بيوسيتامول)</td> <td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>مجموعة الفوسفاتيز القلوية (DEA) النظام</td> <td>السريري المرجاني ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>محلل آلي</td><td>توليب ، ألتو سانتراكروز ، الهند</td><td>محلل</td><td>الكيمياء الحيوية للاختبار الوظيفي للكبد</td></tr><tr><td>البيتادين ( محلول بوفيدون اليود)</td><td>وين-ميديكير; &nbsp; الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr><tr><td>خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الأولى)</td> <td>كارتوس الدولية؛ الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) مجهر</td></tr> <tr><td>المجال الساطع</td><td>أوليمبوس ، اليابان</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>CBA / J الفئران الفطرية</td><td>مختبر جاكسون</td><td>رقم الأسهم 000654</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim)</td> <td>AlKem ; حقن الصوديوم سيفوتاكسيم الهند</td><td></td><td>، لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>مصفاة الخلية</td><td>سيجما ؛ الولايات المتحدة</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز النوع الأول</td><td>Gibco من Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>براعم القطن</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd ؛ الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) DPX</td></tr> <tr><td>Mountant</td><td>Sigma ; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>ورقة الستارة</td><td>JSD الجراحية ، دلهي ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>محلول Eosin Y ،</td><td>سيجما الكحولي ؛ الولايات</td><td>المتحدة HT110132</td><td></td></tr><tr><td>الملقط</td><td>الجراحي الكبرى; الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>نظام التخدير بالغاز</td><td>Ugo Basile ؛ إيطاليا</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>جلوكوز</td><td>هيميديا ، الهند</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>كريم إزالة الشعر (Veet) ريكيت</td> <td>بينكيزر ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) محلول</td></tr> <tr><td>الهيماتوكسيلين ، مايرز</td><td>سيجما ؛ الولايات المتحدة</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم الهيبارين</td><td>هيميديا; الهند</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>hyaluronidase من الخصيتين الأغنام</td><td>سيجما ; الولايات المتحدة</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>IV قنية (Plusflon)</td> <td>Mediplus ، الهند</td><td>المرجع 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>محااقن الأنسولين</td><td>BD ؛ الولايات المتحدة</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Forane)</td> <td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>استنشاق الكيتامين</td></tr><tr><td>المخدر (Ketamax)</td> <td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>الكيتامين هيدروكلوريد IP, لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية) حاملات</td></tr> <tr><td>الإبر الصغيرة مستقيمة ومنحنية</td><td>مرسيان ؛ &nbsp; إنجلترا</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>حاملات الإبرة الصغيرة على التوالي & منحني</td><td>Mercian ; &nbsp; إنجلترا</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>مختبرات Microtome Histo-Line ، إيطاليا</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>خيط النايلون</td><td>العظيم ؛ الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>بارافورمالدهايد</td><td>هيميديا ؛ الهند</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears / Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited / Sun Pharma ، الهند</td><td>P3060</td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia ؛ الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr><tr><td>مشرط</td><td>الجراحات الكبرى; الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>مقص</td><td>العمليات الجراحية الرئيسية. الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td> CORALAL <td>CLINICAL SYSTEM ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>CORALAL CLINICAL SYSTEM ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ؛ الولايات المتحدة</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما ; الولايات المتحدة</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>الشفرة الجراحية رقم 22</td><td>La Medcare ، الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>اللوحة الجراحية</td><td>محليا</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>الشريط الأبيض الجراحي</td><td>3M الهند ؛ الهند</td><td>1530-1</td> خيوط <td>الشريط الجراحي Micropore</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon و Johnson & amp جونسون ، الهند</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>محاقن (1 مل ، 26 جم)</td> <td>ديسبو فان ؛ الهند</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr> <tr><td>ماكينة التشذيب (Clipper)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>ماكينة الوزن</td><td>Braun</td><td></td><td>لا يوجد رقم كتالوج محدد (المشتريات المحلية)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; الهند</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>زيلازين (زيلاكسين) الهندي</td> <td>المناعي المحدود</td><td></td><td>مهدئ ، قبل التخدير ، مسكن ومرخي للعضلات</td></tr></tbody></table>

التشريح المجهري لعين القوارض

Microdissection of the Rodent Eye

يتضمن تشريح العين الدقيقة لعين القوارض تجزئة مقلة العين المنزوعة النواة مع الغشاء المتصل ، أو الجفن الثالث ، للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية. باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على الأجزاء الفرعية للعين ، بما في ذلك أنسجة القرنية والأنسجة العصبية والأنسجة الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) والعدسة ، من أجل التركيب الكامل ، والتقسيم بالتبريد ، و / أو معلقات الخلية المفردة لنسيج عيني معين. يقدم وجود الجفن الثالث مزايا فريدة ومهمة ، لأنه يفيد في الحفاظ على اتجاه العين ، وهو أمر مهم لفهم فسيولوجيا العين بعد أي تدخل موضعي أو في الدراسات التي تنطوي على تحليل العين المتعلق بالتضاريس المكانية للعين.
في هذه الطريقة ، قمنا باستئصال مقلة العين في التجويف جنبا إلى جنب مع الجفن الثالث عن طريق قطع عضلات العين بعناية وببطء وقطع العصب البصري. تم ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية باستخدام microblade. تم استخدام الشق كنقطة دخول ، مما يسمح بالقطع على طول تقاطع القرنية الصلبة عن طريق إدخال مقص دقيق من خلال نقطة الشق. تم إجراء جروح صغيرة ومستمرة على طول المحيط حتى انفصلت الكؤوس. يمكن تشريحها بشكل أكبر عن طريق تقشير الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية برفق باستخدام ملقط خياطة كوليبري للحصول على الشبكية العصبية وطبقات RPE. علاوة على ذلك ، تم إجراء ثلاثة / أربعة قطع متساوية البعد من المحيط بشكل عمودي على المركز البصري حتى تم الوصول إلى العصب البصري. فتح هذا الكؤوس نصف الكروية في شكل زهرة بحيث سقطت مسطحة ويمكن تركيبها بسهولة. تم استخدام هذه التقنية في مختبرنا لتركيب القرنية بالكامل وأقسام الشبكية. يحدد وجود الجفن الثالث الاتجاه الأنفي الصدغي ، والذي يسمح بدراسة تدخلات العلاج بالخلايا المختلفة بعد الزرع ، وبالتالي ، التحقق الفسيولوجي المستهدف الحيوي للتصور والتمثيل الدقيق في مثل هذه الدراسات.

تم إعداد مجموعة كاملة من أنسجة عين الفأر / القرنية rd1 لدراسة تكوين الأوعية اللمفاوية المحتملة في الأنسجة الأمامية / القرنية في حالة مرضية. كان نسيج الملتحمة المرفق من الجفن الثالث بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، لأن القرنية تفتقر إلى الأوعية اللمفاوية. بالنسبة للدراسة ، تم تشريح أنسجة القرنية بالملتحمة وتم تثبيتها بنسبة 4٪ PFA ، تليها النفاذية والانسداد. ثم تم تلطيخ الأنسجة بجسم مضاد أولي ضد علامة البطانة اللمفاوية (LYVE1)9. تبع ذلك حضانة بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة Alexa Fluor 488 (أخضر). تم التقاط الص...

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتشريح الدقيق للعين في القوارض. تتضمن العملية استئصال مقلة العين جنبا إلى جنب مع الغشاء النيكتيتي (أي الجفن الثالث). ثم يتبع ذلك فصل كؤوس العين الخلفية والأمامية.

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

اعتمدت أبحاث العين في الأوقات السابقة في الغالب على أنسجة العين من الأفراد المتوفين. ومع ذلك ، على مر السنين ، تم تطوير العديد من نماذج القوارض العينية وتضاءلت الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. نظرا لصغر حجمها ومحدودية مساحة العمليات في عين القوارض ، فإن الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين مقيد بشدة.عادة ، للعمل على عين القوارض ، يتم تجميد العين عن طريق العصب البصري ويتم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة الهشة حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة في عزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند تشريح الأنسجة.علاوة على ذلك ، من الصعب تحديد موقع التدخل المستهدف بعد التشريح بسبب التجمع الخلوي المتجانس لكأس العين الخلفي والأمامي. في هذا الفيديو ، يتم عرض طريقة جراحية معدلة للتشريح المجهري. يقدم وجود الغشاء المرفق ، أو الجفن الثالث ، مزايا فريدة ومهمة.في هذه الطريقة ، يتم أولا استئصال مقلة العين بالجفن الثالث ، ثم يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين. يتبعه ثقب مقلة العين من خلال ليمبوس القرنية ، ويتم استخدام الشق كنقطة دخول. ثم ، عن طريق قطع على طول المحيط ، يتم فصل أكواب العين الأمامية والخلفية.من خلال تشريح كوب العين الخلفي بشكل أكبر ، يتم تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. وبالتالي يتم الحصول على الطبقات العصبية و RPE لمزيد من المعالجة. سيمكننا الجفن الثالث من تحديد الاتجاه المكاني لاستئصال العين بعد الاستئصال.دعونا الآن نتبع الإجراء التفصيلي خطوة بخطوة. تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين ووضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل العملية. القتل الرحيم للحيوان عن طريق إعطاء جرعات التخدير خمس مرات داخل الصفاق.الجرعة النموذجية هي 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 10 ملغ من الكيتامين وواحد من الزيلازين. تأكد من عدم الاستجابة الكاملة للتحفيز من خلال فحص منعكس الدواسة. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين.احتفظ بملقط خياطة كوليبري ، وملقط منحني ، وشفرة صغيرة بحجم 15 درجة وثلاثة ملليمترات ، ومقص زنبركي صغير ، ومقص صغير بزاوية جاهزة للإجراء. ضع ملقط منحني حول مقلة العين واضغط لتحرير العين من المرفقات الدخيلة. يقع الجفن الثالث ، المعروف أيضا باسم الغشاء النخاعي ، باتجاه الزاوية العليا من الظل الأنفي ويمكن تحديده على أنه نتوء شفاف ثانوي مع حدود مصطبغة.بعد ذلك ، استخدم مقصا صغيرا زنبركيا وقطعه حول مقلة العين. تعمل الجروح الصغيرة المستمرة على تحرير مقلة العين من ملحقات الصلبة. ضع مقصا صغيرا زنبركيا منحنيا تحت مقلة العين لتحرير العين عن طريق قطع العصب البصري.ضع العين المنزوعة النواة في طبق بتري يحتوي على مخزن مؤقت ل PBS بحيث يتم غمر مقلة العين في برنامج تلفزيوني. ستبدأ بعض العضلات أو الأنسجة خارج العين في الطفو بعيدا عن مقلة العين. قم بإزالتها عن طريق قطعها عن مقلة العين باستخدام مقص زنبركي صغير.بعد ذلك ، قم بإزالة العصب البصري من قاعدة مقلة العين للسماح بفصل أفضل للشبكية للاستعدادات الكاملة. ليس من الضروري إزالة العصب البصري لتقسيم الأنسجة. نقل مقلة العين إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على مل واحد من 4٪ بارافورمالدهيد أو PFA.احتفظ بها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية لتثبيت الأنسجة. من الممكن التوقف عند هذه الخطوة عن طريق ترك الأنسجة في PFA لمدة تصل إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية. ومع ذلك ، لعزل الخلايا الحية ، لا ينبغي تنفيذ خطوات التثبيت ويجب تنفيذ الإجراء بأكمله بشكل مستمر.بعد تثبيت PFA ، انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني وضعه تحت مجهر تشريح لتنفيذ الإجراء اللاحق. شل حركة مقلة العين عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث بإحكام باستخدام ملقط كوليبري للخياطة. الحافة هي تقاطع القرنية الصلبة.قم بعمل شق صغير في الحافة عن طريق ثقبه باستخدام شفرة صغيرة. يفضل إجراء شق مقابل الجفن الثالث. بعد ذلك ، باستخدام هذا الشق كنقطة انطلاق ، باستخدام المقص الدقيق ، قم بعمل جروح صغيرة ومستمرة على طول محيط الحافة الصلبة للقرنية.أولا ، أكمل نصف دائرة من الجروح بدءا من نقطة الشق حتى الجفن الثالث. ثم أكمل نصف الدائرة المتبقية من التخفيضات على الجانب الآخر. أخيرا ، قم بعمل قطع حول الجفن الثالث لفصل الكأس الخلفي والأمامي.قم بإزالة العدسة من الكأس الخلفي باستخدام ملقط للحصول على الكأس الخلفي المكون من الشبكية العصبية وطبقة RPE والكأس الأمامية للقرنية. في حالة العمل مع الأنسجة غير الثابتة ، يمكن الآن هضم الكؤوس الأمامية والخلفية إنزيميا للحصول على تعليق القرنية أو الشبكية أحادي الخلية. لتثبيت الأنسجة ، انقل هذه الأكواب إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA لمدة 12 ساعة عند أربع درجات مئوية.بعد التثبيت ، يمكن تضمين الأنسجة في وسط مناسب ويمكن إجراء التقسيم بالتبريد أو تقسيم البارافين للحصول على أقسام القرنية أو الشبكية. أعد إدخال الكوب الخلفي في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. الطبقة المعتمة على طبقة RPE المصطبغة هي الشبكية العصبية.انزع الشبكية العصبية باستخدام ملقط ثان. يوصى بشدة بحركة يد لطيفة وخفيفة للغاية حتى لا تتلف الأنسجة. عند العصب البصري ، يمكن إدخال مقص الزنبرك المنحني تحت الشبكية العصبية ، ويمكن إجراء قطع لتحرير الطبقات تماما إذا ظلت الشبكية العصبية متصلة.يمكن أيضا تحرير شبكية العين أو فصلها عن طريق التمسيد بها برفق بفرشاة ناعمة. أعد إدخال الأكواب الأمامية والخلفية في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. استخدم مقصا صغيرا بزاوية زنبركية لعمل قطع بجوار الجفن الثالث من المحيط بشكل عمودي باتجاه المركز البصري.الحفاظ على قبضة الجفن الثالث وجعل قطع بجانب القطع الأول. قم بعمل قطع مماثل بين القطع الثاني والجفن الثالث. ثلاثة أو أربعة قطع متساوية البعد تفتح الكؤوس نصف الكروية على شكل زهرة ، والتي تسقط بشكل مسطح ويمكن تركيبها بسهولة.لا تقم بعمل جروح عميقة جدا حتى مركز الكوب ، لأن هذا قد يجعل أقسام الأوراق تنهار أو تنفصل بسهولة. يسمح الوسط السائل لكوب العين الأمامي بالوصول إلى بنية منحنية. اتبع نفس الخطوات المعطاة لإجراء جروح على الكوب الخلفي لإجراء ثلاث أو أربع جروح متساوية البعد على الكوب الأمامي.الأنسجة جاهزة الآن لمزيد من التلطيخ. في هذا الشكل، يوضح الكوب الأمامي بالكامل. تم تشريح أنسجة القرنية كما هو موضح للكشف عن الأوعية اللمفاوية في نسيج الملتحمة المرفق بنشرة القرنية.في هذا الشكل، يوضح الشكل الشبكية العصبية بالكامل. كانت الأوعية الدموية في شبكية العين العصبية ملطخة ب Isolectin ويمكن رؤيتها كأوعية خضراء. في هذه الطريقة ، يتم الحصول على مقلة العين المنزوعة النواة للفئران مع الجفن الثالث المرفق للتعامل الفعال والسهل.الجفن الثالث يجمد مقلة العين تماما ويسمح للتشريح بالمضي قدما بسهولة وبأقل قدر من الأخطاء. هذه الطريقة مفيدة للتقسيم الخاص بأنسجة العين ، وتحليل الخلية الواحدة ، والتركيب الكامل. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تثبيت الأنسجة المتكررة تجعل الأنسجة غير قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو ضرورات الخلايا الحية هذه.ومن ثم ، يجب تنفيذ الإجراء في سلسلة متصلة لعزل الخلايا الحية.

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

مظاهرة رسمية للتشريح العين الماوس ، مما أدى إلى تحميل كامل من الظهارة الصبغية الشبكية.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

تقنية تشريح يوضح قلع العين الماوس لتثبيت الأنسجة لأداء phenotyping في شاشات عالية الإنتاجية.

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

يصف هذا التقرير الطرق الشاملة لإعداد أقسام شبكية العين المجمدة للكيمياء المناعية (IHC).  وتشمل الأساليب الموصوفة تشريح كوب العين الخلفي، تثبيت البارافورمالديهايد، وتضمينها في درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) وسائل الإعلام واتجاه الأنسجة، وتقسيم ومناعة.

إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية

يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

الهدف من هذا البروتوكول هو توصيف نموذج جديد للتنكس العصبي الزرق على أساس الكي الحراري 360 درجة للضفيرة الوعائية الحوفية ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم العيني تحت الحاد.

الكي الكامل الدائرة للضفيرة الوعائية الداكنة حول القزحية للزرق المستحث جراحيا في القوارض

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتحضير النسيجي للشرائح من مقل عيون القوارض. باستخدام الطريقة المقترحة ، يمكن تصور شبكية العين الداخلية وتقييمها بسهولة تحت المجهر الضوئي. يتم تقديم الإجراء لمقل عيون الفئران والجرذان.

تحضير وتحليل الشرائح النسيجية لمقل عيون الفئران والفئران لتقييم شبكية العين

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

يصف هذا البروتوكول إجراء عزل شبكية العين الفأرية بالكامل وإجراء التلوين المناعي لتسمية جميع خلايا العقدة الشبكية (RGCs). يتبع العملية التصوير والعد التلقائي ل RGCs باستخدام البرامج القائمة على الذكاء الاصطناعي ، مما يوفر طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة لقياس RGCs في شبكية الفأر بأكملها.

تلطيخ مناعي كامل التثبيت والعد التلقائي لخلايا العقدة الشبكية للفأر

يتم وصف بروتوكول لإعداد استئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء التلوين المناعي على المستقبلات الضوئية. تمكن هذه المقالة الباحثين من إنتاج أقسام مجمدة لشبكية العين باستمرار مع مورفولوجيا محفوظة جيدا ونتائج تلطيخ مناعي عالية الجودة.

التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر

تظهر شبكية العين تنظيما مكانيا معقدا عبر هيكلها الرقائقي. تتطلب تقنيات النسخ المكاني والتسلسل المكانية الحديثة أقساما &lt; الأنسجة بسمك 20 ميكرومتر ، مما يحد من قابليتها لتطبيق أبحاث الشبكية. تنتج طريقة التقطيع بالتبريد المجمدة حديثا أقساما رقيقة من شبكية العين مع الحفاظ على العلاقات المكانية المستوية ، مما يتيح رسم خرائط جزيئية شاملة عبر الصفائح.

أون الوجه التقطيع بالتبريد لشبكية العين الفأرية للتحليل الجزيئي المكاني عالي الأبعاد

تعلم تقنية التشريح المجهري لعين القوارض باستخدام الغشاء الرافع الثالث لتحسين الوصول إلى الأجزاء الداخلية وتقليل تلف الأنسجة. هذه الطريقة تُمكّن الباحثين من عزل طبقات الشبكية بدقة أعلى.

التشريح المجهري لعين القوارض

استكشف المزيد من الفيديوهات