طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

هذه طريقة مباشرة لمراقبة الأنماط الظاهرية الخلوية وخصائص نوى R-pass. يمكن أيضا استعادته في كثير من الأحيان في دراسة على مستوى الجينوم للعثور على العوامل الوراثية التي تؤثر على استقرار نوى R-pass. نظرا لأن هذا كائن حركي راسخ ، فإن هذه التقنية سهلة ولا تتطلب الكثير من الوقت والجهد مقارنة باستخدام خطوط الخلايا البشرية أو النماذج الحيوانية.

يرتبط تجميع نوى R-pass ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون. يمكن اختبار البروتينات أو المواد الكيميائية التي من المحتمل أن تؤثر على استقرار نوى R-pass في نموذج الخميرة المتوافق مع البشر. للبدء ، قم بتصحيح ثلاث مستعمرات مفردة على لوحة أجار SD-URA لاختيار الخلايا التي تحتوي على بلازميدات ألفا سينوكلين.

بعد ذلك ، قم بتلقيح محولات الخميرة ثلاثية البقع لكل سلالة إلى 3 ملليلتر من SRD-URA للنمو الانتقائي للخميرة التي تحتوي على البلازميدات مع 2٪ رافينوز لتثبيط تحريض ألفا سينوكلين تحت محفز Gal1 و 0.1٪ جلوكوز. احتضان الثقافة الملقحة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل إلى 3 ملليلتر من SRD-URA الطازج حتى تصل إلى كثافة بصرية تبلغ 0.2 عند 600 نانومتر.

بعد ذلك ، احتضان الثقافة لمدة ست ساعات عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بتخفيف العينات إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 600 نانومتر بالماء المقطر المعقم في الحارة 1 من لوحة 96 بئرا لمعادلة عدد الخلايا في كل مزرعة.

قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 5 أضعاف لخلايا الخميرة عن طريق إضافة 160 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى الممرات الخمسة التالية وتأكد من حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر عند تخفيف الخلايا بشكل متسلسل في كل حارة. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولتر من كل بئر لاكتشاف العينات على ألواح أجار SD-URA للعناصر التحكم وألواح أجار SG-URA لمراقبة السمية. احتضان الصفائح المرقطة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام.

التقط صورا للصفائح كل 24 ساعة حتى اليوم الرابع ثم حلل البيانات من خلال مقارنة اختلافات النمو بين السلالات التي رصدتها العين. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة الثلاثة لكل سلالة إلى ثلاثة ملليلتر من SRD-URA واحتضانها عند 30 درجة مئوية تحت الإثارة بمعدل 200 دورة في الدقيقة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة البصرية للخلايا المزروعة طوال الليل عند 600 نانومتر وتلقيح الخلايا إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر من SD-URA و SG-URA الطازجة في 96 لوحة بئر.

اضبط الحجم النهائي بما في ذلك الخلايا على 200 ميكرولتر واضبط الكثافة البصرية الأولية للخلية على 0.05 عند 600 نانومتر. اضبط إعدادات البرنامج في لوحة المعايرة الدقيقة. اضبط درجة الحرارة المستهدفة على 30 درجة مئوية ، ووقت الفاصل الزمني على 15 دقيقة ، ومدة الاهتزاز على 890 ثانية ، وسعة الاهتزاز على 5 ملم ، والقياس على أنه امتصاص عند 600 نانومتر.

احتضان اللوحة لمدة 2-3 أيام لجميع السلالات للوصول إلى المرحلة الثابتة في قارئ الصفيحة الدقيقة. تحليل البيانات عن طريق رسم منحنى النمو. قم بتلقيح محولات الخميرة المرقعة إلى 3 ملليلتر من SRD-URA واستزرعها طوال الليل عند 30 درجة مئوية تحت التحريك بمعدل 200 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، أعد تلقيح الخلايا المستزرعة طوال الليل إلى 3 ملليلتر من SRD-URA الطازج إلى كثافة بصرية تبلغ 0.003 عند 600 نانومتر ، ثم احتضان الثقافة عند 30 درجة مئوية تحت التحريض عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى تصل الكثافة البصرية إلى 0.2. ثم أضف 300 ميكرولتر من 20٪ من الجالاكتوز ، ثم احتضن لمدة 6 ساعات أخرى عند 30 درجة مئوية تحت التحريض بمعدل 200 دورة في الدقيقة. جمع ملليلتر واحد من ثقافة الخلية عن طريق الطرد المركزي في 800 غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف .

أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 30 ميكرولتر من الماء المقطر. تحضير وسادة هلام agarose على شريحة زجاجية. أعد تعليق الخلايا وقم بتحميل خمسة ميكرولترات من إعادة تعليق الخلية على الشريحة الزجاجية ، وقم بتغطية الخلايا باستخدام وسادة الأغاروز المقطوعة للفحص.

لإجراء التصوير المجهري بهدف 100x ، استخدم خيار التقاط الشاشة لتوليد الصور باستخدام البرنامج وحدد brightfield لتركيز الخلية بهدف 100x باستخدام زيت الغمر. قم بالتبديل إلى مرشح مضان GFP واضبط وقت تعريض الصورة إلى ما بين 50 مللي ثانية و 300 مللي ثانية للحصول على صورة واضحة من خلال موازنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. افتح ملف الصورة وقم بتحليل البيانات عن طريق حساب الخلايا بناء على عدد البؤر في الخلايا باستخدام برنامج تحليل الصور.

أظهر تعبير السينوكلين تحت محفز Gal1 في ناقل PRS426 تأخرا كبيرا في النمو على صفيحة الأجار التي تحتوي على الجالاكتوز كمحفز. كما لوحظ الفرق في النمو عن طريق تعبير synuclein في الثقافات السائلة. في كلتا الحالتين ، أظهر السينوكلين من النوع البري والمتغيرات ذات طفرات E46K أو A53T عيوبا في النمو بسبب سمية السينوكلين.

ومع ذلك ، أظهر متغير synuclein A30p ، الذي لا يشكل مجاميع ، نمطا ظاهريا غير سام. أظهرت السلالات التي تظهر سمية خلوية شديدة بؤر مجاميع سينوكلين ، ولكن في متغير A30p ، تم نشر شكل أقل سمية من synuclein في جميع أنحاء الخلايا. لتحقيق نتائج قابلة للتكرار ، من المهم استخدام الخلية في نفس مرحلة النمو في كل تجربة ، خاصة عند مراقبة الأنماط الظاهرية المرتبطة بالسينوكلين.

كما أوضحنا في بيانات المجهر الفلوري ، يمكن أن يشكل synuclein مجاميع أكبر. لذلك ، يمكن تجزئته ببساطة عن طريق الطرد المركزي ويمكن قياسه كميا عن طريق النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالسينوكلين. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الفحص عالي الإنتاجية للعثور على عوامل وراثية جديدة ومركبات كيميائية تؤثر على تجميع سينوكلين.

وبالتالي ، نأمل في العثور على مرشحين علاجيين جدد لمرض باركنسون.