Name: تصوير قوقعة الشيخوخة باستخدام المجهر الفلوري ذو الصفيحة الضوئية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: استكشف تصوير القوقعة ثلاثي الأبعاد باستخدام المجهر الضوئي الصفحي لدراسة تغيرات الشيخوخة في الخلايا الشعاعية والعصبية الحلزونية. هذه الطريقة تتيح تحليلاً دقيقاً لصحة السمع دون تلف نسيجي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا البحث بمنح من المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى التابعة للمعاهد الوطنية للصحة ، ومؤسسة Kellogg ، والتبرعات الخاصة من بريدجيت سبيرل وجون ماكورميك. تم تطوير TSLIM بمساعدة ممتازة من ماتياس هيلينبراند ، وكيرستين جون ، ومايكي لاوين ، وميشيل لاهير ، وتوبياس شروتر ، وبيتر شاخت ، وأوليفر دانبرغ ، وجوليان ويستر من الجامعة التقنية في إلميناو ، ألمانيا ، تحت إشراف مرشديهم (ستيفان سينزينغر ورينيه ثيسكا) وجيمس ليجر.

تمت مراجعة جميع الإجراءات واستخدام الحيوانات الحية والموافقة عليها (معرف البروتوكول # 2010-38573A) من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي بجامعة مينيسوتا (IACUC) وتم تدريب المحققين الذين يستخدمون هذه الحيوانات واختبارها بدقة من قبل الأطباء البيطريين للموارد الحيوانية البحثية (RAR) قبل أن يتمكنوا من الوصول إلى مرافق الحيوانات. تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث في هذه الدراسة.
1. إزالة القوقعة للتثبيت ومعالجة الأنسجة للتصوير
<ol><li>القتل الرحيم للفأر باستخدام استنشاق CO2 . قطع رأس الفأر بالمقص وإجراء شق ظهري بطني عبر الدماغ لإصابة الجمجمة. قم بإزالة الدماغ ، وحدد الفقاعة المستديرة في الجزء القاعدي البطني من الجمجمة ، وافتح الفقاعة باستخدام rongeurs ، وتصور القوقعة وأزلها.</li>
	<li>التثبيت: قم بإجراء هذا الإجراء تحت غطاء دخان واستخدام مجهر تشريح بتكبير 5x. ارتداء القفازات والملابس الواقية. ثقب النافذة البيضاوية وإزالة الركابي مع اختيار حاد. أدخل معولا في النافذة المستديرة لثقب الغشاء.</li>
	<li>قم بتغطية النافذة المستديرة المفتوحة بطرف مقطوع لمجموعة تسريب متصلة بحقنة سعة 1 مل مملوءة ب 2 مل من الفورمالين. قم ببث الفورمالين ببطء من خلال المساحات المحيطة باللمفاوية للقوقعة على مدى فترة 2 دقيقة ، مع ملاحظة أن الفورمالين يخرج من القوقعة عبر النافذة البيضاوية المفتوحة. قم بقص الأنسجة الزائدة من القوقعة واغمرها في زجاجة تحتوي على 10٪ فورمالين ، وضعها على المدور طوال الليل.</li>
	<li>إزالة الكالكة: شطف القوقعة في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما وانغمس في زجاجة تحتوي على محلول 10٪ من حمض ثنائي إيثيلين ديامينيترايتيك ثنائي الصوديوم (EDTA) مع الدوران لمدة 4 أيام ، وتغيير المحلول يوميا.</li>
	<li>الجفاف: قم بلف القوقعة باستخدام PBS 3x وانغمس لمدة 15 دقيقة بين التغييرات. تجفيف القوقعة بتركيزات تصاعدية من الإيثانول 10٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 95٪ ، 95٪ ، 100٪ ؛ لمدة 30 دقيقة في كل تركيز. ملاحظة: من المهم إزالة كل EDTA قبل الجفاف حيث يترسب EDTA في الإيثانول. أيضا ، يمكن ترك القوقعة في أي تركيز من الإيثانول أكبر من 70 ٪ بين عشية وضحاها.</li>
	<li>تلطيخ: تلطيخ القوقعة بأكملها عن طريق الغمر في محلول من أيزوثيوسينات رودامين ب (5 ميكروغرام / مل في الإيثانول بنسبة 100٪) طوال الليل مع الدوران. قم بإزالة الصبغة الزائدة من القوقعة مع تغييرين من الإيثانول بنسبة 100٪ ، 5 دقائق لكل تغيير.</li>
	<li>المقاصة: انقل القوقعة الملطخة إلى تغييرين من محلول Spalteholz12 (5: 3 ساليسيلات الميثيل: بنزوات البنزيل) ، 30 دقيقة لكل تغيير واتركه طوال الليل في محلول المقاصة مع الدوران. يمكن ترك القوقعة في محلول Spalteholz إلى أجل غير مسمى.</li>
</ol>2. تصوير القوقعة
<ol><li>قم بتوصيل القوقعة بقضيب عينة في نهاية غشاء النافذة البيضاوية والمستديرة بحيث يظل محلول المقاصة داخل القوقعة ولا تتشكل الفقاعات (الشكل 2). يجب الحرص على عدم ترك الفقاعات تتشكل داخل القوقعة حيث يصعب إزالتها وإذا تركت في الأنسجة ، فإنها ستسبب قطعا أثرية للتصوير.</li>
	<li>استخدم غراء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية لربط القوقعة الرطبة بقضيب العينة الجافة (الشكل 2). نعلق القوقعة في نهايات النافذة البيضاوية والمستديرة. عالج غراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 ثوان عن طريق التحرك حول القوقعة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ملاحظة: سيؤدي الارتباط الفضفاض للقوقعة بقضيب العينة إلى حدوث عيوب في التصوير. تم تصنيع هذا القضيب خصيصا لهذا البروتوكول (انظر Santi et al.8 للحصول على التفاصيل) وهو خاص بمجهر الصفيحة الضوئية الخاص بنا.</li>
	<li>القوقعة في حجرة التصوير المملوءة بمحلول سبالتيهولز للتصوير. غرفة العينة عبارة عن خلية فلورية كوارتز واضحة بصريا (فيديو 1).</li>
	<li>قم بتوصيل قضيب العينة بحامل دوار متصل أيضا بمرحلة ترجمة XZ. يتم الحصول على معظم المداخن عن طريق ترجمة العينة في طائرات XZ ، ولكن يمكن أيضا الحصول على مداخن دورانية.</li>
	<li>التقسيم البصري TSLIM: استخدم ليزر أزرق أو أخضر للإثارة اعتمادا على نوع تلطيخ الفلوروكروم. ضع ورقة الضوء في منتصف النسيج للتركيز وحدد التكبير الذي سيتم استخدامه لإضاءة العرض الكامل للقوقعة. بعد ذلك ، استخدم برنامجا مصمما خصيصا لتحريك العينة عبر ورقة الضوء عبر العينة في المحور X (خياطة الصورة) وفي خطوات Z لإنشاء كومة من صور 2D في جميع أنحاء القوقعة.</li>
	<li>بالنسبة للصورة الأولى ، يتم وضع خصر شعاع الورقة الضوئية على حافة العينة ويقوم البرنامج بمسح العرض الكامل للعينة التي تجمع أعمدة البيانات (انظر خياطة الصورة ؛ Santi et al.8) التي هي عرض المعلمة متحدة البؤر (الشكل 3) لإنتاج صورة ثنائية الأبعاد مركبة ذات دقة قصوى عبر عرض العينة. يقوم البرنامج بأتمتة خياطة الصور لكل خطوة Z حتى يتم تصوير العينة بالكامل.</li>
	<li>معالجة الصور: نقل مكدس الصور إلى كمبيوتر آخر وتحميله في برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة البناء والقياس الكمي.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

التقسيم البصري بواسطة المجهر الضوئي لفحص هياكل القوقعة ليس مدمرا ميكانيكيا مثل الطرق النسيجية التقليدية الأخرى ، ويوفر رؤية رقمية كاملة لهياكل القوقعة بالنسبة لبعضها البعض. قدمت الطرق السابقة مثل الاستعدادات السطحية لجهاز Corti14 خريطة لفقدان خلايا الشعر على طول الغشاء القاعدي ، ولكن لا يمكن تقييم فقدان SGN حيث تم تشريح الأنسجة للكشف عن عضو كورتي. بدلا من ذلك ، توفر أقسام الميكروتوم متوسطة الوحدات من القوقعة عينة صغيرة جدا فقط من حالة SGNs على طول قناة روزنتال. مع TSLIM ، يتم رقمنة جميع هياكل القو...

القوقعة هي العضو الحسي المحيطي للسمع في الثدييات. يحتوي على تشريح حلزوني معقد لتكرار الخلايا الحسية والداعمة المتخصصة تشريحيا للكشف عن الاهتزازات الصوتية ونقلها إلى الدماغ لإدراك السمع. العناصر الحسية الرئيسية هي خلايا الشعر الداخلية والخارجية وأليافها العصبية المعصبة التي تشكل أجسامها الخلوية العقدة الحلزونية التي تقع داخل قناة روزنتال (الشكل 1). يتم ترتيب هذه الهياكل الحسية والعصبية بشكل صوتي بحيث يتم تحويل الأصوات عالية التردد في قاعدة القوقعة ويتم تحويل الأصوات منخفضة التردد في قمة القوقعة2. تسمى الخريطة التشريحية لتوزيع الخلايا الحسية على طول الطول الحلزوني للغشاء القاعدي الداعم مخطط القوقعةالخلوي 3 ويمكن مقارنتها بفقدان السمع كدالة للتردد كما هو موضح في مخطط السمع.
المتاهة الغشائية للقوقعة ، المحاطة بعظام كثيفة ، تجعل من الصعب تقنيا فحص أكثر من بنية قوقعة واحدة في وقت واحد. لذلك ، فإن الأساس المنطقي لتطوير مجهر ورقة الضوء هو إنتاج مقاطع تسلسلية محاذاة بشكل جيد من القوقعة الكاملة بحيث يمكن فحص جميع هياكل القوقعة بالنسبة لبعضها البعض في عمليات إعادة البناء 3D. صمم Voie et al.4 و Voie and Spelman5 أول مجهر للصفائح الضوئية ، يسمى مجهر المقطع البصري الفلوري المستوي المتعامد (OPFOS) ، لتقسيم القوقعة بأكملها بصريا. ومع ذلك ، لم يتم تطوير هذا المجهر تجاريا. لذلك ، كان هدفنا هو بناء مجهر ورقة ضوئية يسمى مجهر التصوير بالليزر ذو الألواح الرقيقة (TSLIM; الشكل 2). تم نشر تفاصيل التصميم والبناء ل TSLIM سابقا8. أجرى TSLIM العديد من التحسينات على OPFOS ، بما في ذلك استخدام كاميرا رقمية منخفضة الإضاءة مقابل كاميرا CCD لجمع الصور ، وأجهزة تحديد المواقع الدقيقة المشفرة بصريا لحركة دقيقة وقابلة للتكرار للعينة من خلال ورقة الضوء ، واستخدام غرفة عينة متاحة تجاريا وواضحة بصريا ، وتلطيخ Rhodamine في الإيثانول بدلا من محلول المقاصة لمنع ترسيب البقع داخل الأنسجة. ركز التطوير التجاري للمجاهر ذات الألواح الضوئية مثل SPIM6 على التصوير عالي الدقة للعينات الحية الصغيرة الشفافة ولكنها غير مناسبة لتصوير القوقعة بأكملها لأنها تفتقر إلى مسافة العمل الكافية. تم نشر مراجعة لتطوير المجاهر الضوئية الأخرى بواسطة Santi7. الميزة الأساسية ل TSLIM على الطرق النسيجية الأخرى لفحص القوقعة هي تقسيم الأنسجة بصريا لإعادة بناء 3D مع الحفاظ على سلامة العينة بحيث يمكن استخدامها من قبل الطرق النسيجية الأخرى. ميزة أخرى للتصوير TSLIM هي أن ورقة الضوء الرقيقة التي ينتجها الليزر فقط هي التي تتعرض للأنسجة ، مقارنة بتعرض سمك الأنسجة بالكامل لليزر كما هو الحال في الفحص المجهري متحد البؤر. يؤدي تنظيف الأنسجة لتقليل تشتت الضوء وحقيقة تعرض جزء صغير فقط من الأنسجة لليزر إلى الحد الأدنى من تلاشي الفلوروكروم (التبييض الضوئي) باستخدام التصوير بالليزر بالضوء. ومع ذلك، فإن عملية التثبيت والجفاف والتطهير تغير مورفولوجيا هياكل القوقعة وتؤدي إلى انكماش الأنسجة مقارنة بالأنسجة الحية. لم يتم تحديد الكمية الفعلية لانكماش الأنسجة الذي يحدث.
تم تطوير TSLIM من قبل شين جونسون وثمانية طلاب هندسة بصرية ألمان (انظر شكر وتقدير). تم توفير تفاصيل بناء TSLIM بواسطة Santi et al.8 ونسخة مسح (sTSLIM) بواسطة Schröter et al.9. يعمل TSLIM كميكروتوم غير مدمر لعينات المقطع البصري وكمجهر لجمع المقاطع التسلسلية 2D من خلال العرض الكامل وسمك القوقعة. يمكن ل TSLIM تصوير عينات صغيرة (مم) وكبيرة (سم). يتم تثبيت العدسات بالهواء للسماح بمسافات عمل طويلة مع أهداف تجميع 1x و 2x على مجهر التشريح. يحتوي مجهر التشريح أيضا على بصريات تكبير تسمح ل TSLIM بحل الهياكل تحت الخلوية والمشبكية على الخلايا. تم تجهيز TSLIM بليزر أزرق (473 نانومتر) وأخضر (532 نانومتر) للإضاءة يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من مجسات الفلورسنت للتصوير. الهدف من TSLIM هو إنتاج مقاطع بصرية 2D محاذاة بشكل جيد من خلال قوقعة كاملة لإعادة بناء رقمية كاملة لأنسجة القوقعة. نظرا لأنها طريقة فلورية ، يمكن أيضا استخدام الروابط والكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد هياكل قوقعة الأذن المحددة.
في البداية ، تم استخدام عدسة أسطوانية لإنتاج ورقتين ضوئيتين غاوسيتين متعارضتين ، لكنها أنتجت قطعا أثرية لتصوير الامتصاص. بسبب عمل Keller et al.10 ، تم استبدال العدسة الأسطوانية الثابتة بمرآة جلفانومتر المسح لإنتاج ورقة الضوء9. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن مركز ورقة الضوء هو الأنحف عند خصر الشعاع ، يتم إنتاج صور sTSLIM 2D من خلال جمع مركب من أعمدة المحور X للبيانات عبر عرض العينة (الشكل 3). تم وصف هذه الطريقة لأول مرة بواسطة Buytaert و Dircks11. تم تطوير برنامج TSLIM المخصص لقيادة الصور وجمعها باستخدام برنامج رسومي للتحكم في الأداة. تنتقل ورقة الضوء عبر العينة وتضيء مستوى الفلورسنت داخل النسيج. يتم إسقاط هذا المستوى الفلوري بشكل متعامد من خلال العينة الشفافة ويتم جمعه بواسطة مجهر تشريح. تسمح المواضع الدقيقة المشفرة بصريا بالمسح الضوئي من خلال خصر الشعاع في المحور X لجمع صورة ثنائية الأبعاد مركبة واحدة ، وبعد ذلك ، يقوم جهاز تحديد الموضع المجهري للمحور Z بنقل العينة إلى مستوى أعمق داخل الأنسجة للحصول على كومة من الصور التسلسلية ثنائية الأبعاد (الفيديو 1 ، الشكل 4). يتم جمع كومة من الصور الانتقالية من خلال عرض القوقعة وسمكها وطولها بالكامل ، ولا يلزم خياطة الصور (الفيديو 2). يتم نقل مكدس الصور إلى كمبيوتر آخر وتحميله في برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي. تحتوي مكدسات الصور على جميع المعلومات الرقمية حول مورفولوجيا القوقعة بدقة المجهر. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى دقة أعلى ، فيمكن معالجة القوقعة السليمة بشكل أكبر عن طريق الطرق النسيجية المدمرة مثل التقسيم المجهري للميكروتوم والمسح والمجهر الإلكتروني النافذ.
يستخدم برنامج تقديم 3D لتقسيم هياكل القوقعة المختلفة لتقديم 3D والتحليل الكمي. للتجزئة ، يتم تتبع كل بنية في كل صورة 2D من المكدس باستخدام لون مختلف بواسطة لوحة رسومات وقلم (الشكل 5). حتى الآن، تم تقسيم 20 بنية قوقعة مختلفة (الشكل 6). بعد التجزئة ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من تحليلات 3D. على سبيل المثال ، يمكن لبرنامج تقديم 3D استئصال القوقعة فعليا في أي مستوى على طول السنترويد للهيكل. يوضح الفيديو 3 تقسيما عرضيا لعضو كورتي ، والذي يكشف عن خلايا الشعر على طول الغشاء القاعدي. تتطلب هذه العملية أولا تجزئة يدوية لهيكل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم حساب النقطه الوسطى للهيكل بناء على ملاءمة المربعات الصغرى لنقاط الشريحة الموضوعة على طول مركز الهيكل من قاعدته إلى قمته ، مما يسمح بتقريب طول الهيكل (الفيديو 4). يمكن استخدام عملية مماثلة تسمى الهيكل العظمي لتصور العرض الشعاعي للهيكل على طوله باستخدام خريطة ملونة (فيديو 4). يتم حساب الحجم الإجمالي لكل هيكل بواسطة البرنامج بعد التجزئة ، ولكن يمكن أيضا قياس المسافات النسبية وتصورها باستخدام خرائط ملونة في برنامج عرض 3D (الشكل 7). يمكن أيضا تصدير الهياكل المجزأة لإنتاج عروض نماذج بلاستيكية صلبة موسعة (الشكل 8). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء عد الخلايا شبه الآلي باستخدام برنامج تقديم 3D (الشكل 9). يمكن استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية وربط الربيطة لتلطيخ هياكل قوقعة الأذن المحددة ويمكن عزل هذه الهياكل عن هياكل القوقعة الأخرى للتقييم المورفومتري مثل إنتاج مخطط قوقعة خلوي (الشكل 10). يمكن تحديد الطول والعرض والسطح والحجم وعدد جميع هياكل القوقعة من نماذج 3D ، مما يجعل هذا النهج مثاليا لرسم خرائط تلف القوقعة إلى الإعاقات الوظيفية. على وجه التحديد ، يمكن إظهار تلف القوقعة بسبب الشيخوخة أو الصدمات الناجمة عن الضوضاء أو غيرها من الإهانات وقياسها في عمليات إعادة بناء القوقعة 3D من الأقسام البصرية 2D. بمجرد رقمنة قوقعة الأذن، هناك العديد من خوارزميات التصوير التي يمكن استخدامها لتقييم تلف قوقعة الأذن لأي نسيج داخل القوقعة في السجل التشريحي لأنسجة القوقعة الأخرى.

<table><tbody><tr><td>برنامج تقديم Amira 3D</td><td>ThermoFisher العنوان العلمي</td><td></td><td>: 501 90th Ave NW ، Coon Rapids ، MN 55433</td></tr><tr><td>بنزوات البنزيل (W213810)</td> <td>Sigma-Aldrich، Inc. & nbsp ؛</td><td></td><td>العنوان: ص.ب، 14508، سانت لويس، ميزوري 68178</td></tr><tr><td>بونديك&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>العنوان: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada</td></tr><tr><td>Ethanol 95٪ و 100٪&nbsp;</td><td>عنوان جامعة</td><td></td><td>مينيسوتا: المخزن العام ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455</td></tr><tr><td>حمض ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم (EDTA) &nbsp ؛ (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>العنوان: ص.ب ، 14508 ، سانت لويس ، ميزوري 68178</td></tr><tr><td>برنامج LabVIEW الرسومي وأدوات الرؤية</td><td>الوطنية</td><td></td><td>العنوان: 11500 N Mopac Expwy Austin ، TX 78759-3504</td></tr><tr><td>ميثيل ساليسيلات (M6742)</td> <td>Sigma-Aldrich، Inc. &nbsp ؛</td><td></td><td>العنوان: ص.ب ، 14508 ، سانت لويس ، ميزوري 68178</td></tr><tr><td>أوليمبوس MVX10 مجهر تشريح</td><td>أوليمبوس</td><td></td> كورب <td>العنوان: 3500 Corporate Parkway ، سنتر فالي ، بنسلفانيا 18034</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocynate ، (283924) &nbsp ؛</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>العنوان: صندوق بريد ، 14508 ، سانت لويس ، ميزوري 68178</td></tr><tr><td>خلية ستارنا لمقياس الرحاش (3-G-20)</td><td>عنوان خلايا</td><td></td><td>ستارنا: ص.ب 1919 ، أتاسكاديرو ، كاليفورنيا 82423</td></tr></tbody></table>

تصوير قوقعة الشيخوخة باستخدام المجهر الفلوري ذو الصفيحة الضوئية

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

الصمم هو الضعف الحسي الأكثر شيوعا ، حيث يؤثر على حوالي 5٪ أو 430 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وفقا لمنظمة الصحة العالمية1. الشيخوخة أو الصمم الشيخوخي هو السبب الرئيسي لفقدان السمع الحسي العصبي ويتميز بتلف خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) والأوعية الدموية السطورية. توجد هذه التراكيب داخل القوقعة ، التي لها تشريح معقد حلزوني الشكل من الأنسجة الغشائية المعلقة في السائل والمحاطة بالعظام. هذه الخصائص تجعل من الصعب تقنيا التحقيق في التغيرات النسيجية المرضية وقياسها. ولتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير مجهر ضوئي (TSLIM) يمكنه تصوير القوقعة بأكملها ورقمنتها لتسهيل دراسة العلاقات بين البنية والوظيفة في الأذن الداخلية. تؤدي المقاطع التسلسلية المحاذاة جيدا للقوقعة بأكملها إلى كومة من الصور لتقديم حجم ثلاثي الأبعاد (3D) وتجزئة الهياكل الفردية للتصور ثلاثي الأبعاد والتحليل الكمي (أي الطول والعرض والسطح والحجم والعدد). تتطلب القوقعة الحد الأدنى من خطوات المعالجة (التثبيت ، وإزالة الكلس ، والجفاف ، والتلوين ، والمقاصة البصرية) ، وكلها متوافقة مع التصوير عالي الدقة اللاحق عن طريق المسح المجهري الإلكتروني وإرساله. نظرا لوجود جميع الأنسجة في المداخن ، يمكن تقييم كل هيكل بشكل فردي أو بالنسبة للهياكل الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن التصوير يستخدم مجسات الفلورسنت ، يمكن استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية وربط الرباط لتحديد هياكل معينة وحجمها أو توزيعها 3D داخل القوقعة. هنا استخدمنا TSLIM لفحص القوقعة من الفئران المسنة لتحديد فقدان خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام التحليلات المتقدمة (على سبيل المثال ، التحليل العنقودي) لتصور التخفيضات المحلية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية في قناة روزنتال على طول حجمها 3D. توضح هذه الأساليب قدرة المجهر TSLIM على تحديد العلاقات بين البنية والوظيفة داخل القوقعة وفيما بينها.

نظرا لأن موضوع هذا العدد الخاص هو تصوير آثار الشيخوخة في القوقعة ، استخدام قوقعة صغيرة (عمرها 3 أشهر ، HS2479 ، فأر سلالة CBA) وعمر (23 شهرا ، HS2521 ، C57 سلالة الفأر) كأمثلة. تجدر الإشارة إلى أن TSLIM قادر على تصوير مجموعة متنوعة من العينات ، بما في ذلك القوقعة من البشر والثدييات والقوارض الأخرى والأسماك ، وكذلك الأعضاء الأخرى مثل الدماغ.
نشر Johnson et al. 13 مقالا عن SGNs في الفئران الصغيرة (البالغة من العمر 3 أسابيع) CBA باستخدام TSLIM. تم حساب جميع SGNs في خمسة فئ...

تم تطوير مجهر ورقة ضوئية لتصوير ورقمنة القوقعة بأكملها.

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

لقد طورنا مجهرا ضوئيا يمكنه رقمنة القوقعة بأكملها. يحتوي هذا المجهر على أهداف مثبتة بالهواء مع مسافة عمل طويلة يمكنها تصوير قوقعة فأر صغيرة تصل إلى عظم صدغي بشري كبير. يقوم بتقسيم القوقعة بشكل متسلسل باستخدام شعاع ليزر دون التسبب في أي تدمير ميكانيكي.يمكن استخدام طريقة التصوير الخاصة بنا لتقييم التغيرات المرضية في قوقعة الأذن ، مثل فقدان خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية بسبب الشيخوخة. بعد القتل الرحيم وقطع رأس الفأر ، قم بعمل شق ظهري بطني عبر الدماغ لإصابة الجمجمة. إزالة الدماغ وتحديد الفقاعة المستديرة في الجزء القاعدي من الجمجمة.فتح الفقاعة مع rongeurs. ثم تصور القوقعة وأزلها. تحت مجهر التشريح عند التكبير خمس مرات ، قم بثقب النافذة البيضاوية وإزالة الركابي باختيار حاد.ثم أدخل معولا في النافذة المستديرة لثقب الغشاء. لإجراء التثبيت ، قم بتغطية النافذة المستديرة المفتوحة بالطرف المقطوع لمجموعة التسريب المرفقة بحقنة سعة ملليلتر واحدة مملوءة بملليلتر من الفورمالين. قم بضخ الفورمالين ببطء عبر المساحات المحيطة باللمفاوية للقوقعة على مدار دقيقتين، مع التأكد من خروج الفورمالين من القوقعة عبر النافذة البيضاوية المفتوحة.تقليم الأنسجة الزائدة من القوقعة. اغمره في زجاجة تحتوي على 10٪ فورمالين وضعه على دوار طوال الليل. لإزالة الكلس ، شطف القوقعة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما.اغمر في زجاجة تحتوي على محلول 10٪ من EDTA. احتضانها لمدة أربعة أيام مع الدوران ، وتغيير الحل يوميا. بعد ذلك ، قم برش القوقعة باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وانغمس لمدة 15 دقيقة بين التغييرات لإزالة كل EDTA.بعد الغسيل ، قم بتجفيف القوقعة بتركيزات تصاعدية من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في كل تركيز. تلطيخ القوقعة بأكملها عن طريق الغمر في محلول رودامين ب طوال الليل مع الدوران. إزالة الصبغة الزائدة من القوقعة مع تغييرين من الإيثانول 100 ٪ مع الحضانة لمدة خمس دقائق لكل تغيير.انقل القوقعة الملطخة إلى تغييرين من محلول Spalteholz لمدة 30 دقيقة في كل تغيير. اترك بين عشية وضحاها في حل المقاصة مع الدوران. قم بتوصيل القوقعة بقضيب عينة في نهاية غشاء النافذة البيضاوية والمستديرة.تأكد من بقاء محلول المقاصة داخل القوقعة وعدم تكوين الفقاعات. قم بتوصيل نهايات النافذة البيضاوية والمستديرة للقوقعة الرطبة بقضيب العينة الجافة باستخدام غراء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية. عالج غراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 ثوان عن طريق التحرك حول القوقعة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية.القوقعة في غرفة التصوير في خلية مقياس الكوارتز الفلورية الشفافة بصريا المملوءة بمحلول Spalteholz مع قضيب العينة المتصل بحامل دوار متصل أيضا بمرحلة ترجمة X / Z. بعد ذلك ، استخدم برنامجا مصمما خصيصا لتحريك العينة عبر ورقة الضوء في خطوات المحور X و Z وقم بعمل كومة من صور 2D في جميع أنحاء القوقعة. لمعالجة الصورة ، انقل مكدس الصور إلى كمبيوتر آخر وقم بتحميله في برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة البناء والقياس الكمي.أظهر العرض المباشر لحجم قوقعة الفأر النوافذ البيضاوية والمستديرة ، وعضو كورتي بخلايا شعرية ، وتم تقسيم قناة روزنتال وحجمها ، وأظهرت الخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، أو SGNs ، على طولها. باستخدام TSLIM ، تم تصوير قوقعة فأر صغير يبلغ من العمر ثلاثة أشهر وفأر يبلغ من العمر 23 شهرا وحسابهما ل SGNs. أظهرت خلايا SGN كدالة لمسافة قناة روزنتال الموضحة في مخطط خطي SGNs أكبر في الحيوان الأصغر سنا في الأطراف الوسطى والقمية للقوقعة مقارنة بالحيوان الأكبر سنا.تم تصور هذه الخسارة الواضحة لشبكات SGN باستخدام التحليل العنقودي وبرامج تقديم 3D. تم تصوير اختلافات كثافة SGN على مقياس ألوان حيث تكون المجموعات عالية الكثافة صفراء والأزرق يمثل مناطق أقل كثافة. يصور التحليل العنقودي بوضوح المناطق ذات الكثافة الخلوية المنخفضة على طول قناة روزنتال.تم تصميم المجهر ورقة الضوء لإنتاج كومة محاذاة بشكل جيد من الصور التي يمكن من خلالها إنتاج عروض حجم 3D من الهياكل. تسمح برامج تقديم 3D بالتقييم الكمي للهياكل والعلاقات التشريحية بين الهياكل المختلفة. ومع ذلك ، نظرا لأن برامج تقديم 3D تقدم العديد من معلمات المستخدم المختلفة ، فهناك منحنى تعليمي كبير لاستخدام هذه البرامج بشكل فعال.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

تصوير حي من القوقعة الجنينية لدى الثدييات يمثل تحديا لأن العمليات التنموية في متناول اليد تعمل على التدرج الزمني على مدى عشرة أيام. نحن هنا نقدم وسيلة للزراعة ومن ثم تصوير الأنسجة الجنينية مأخوذة من قوقعة النباتى مراسل الماوس الفلورسنت على مدى خمسة أيام.

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

تؤثر الأهداب الأولية على مسارات الإشارات المختلفة. تعتبر قوقعة الثدييات مثالية لفحص إشارات قطبية الخلية المستوية (PCP). يؤثر الخلل الوظيفي الأهدبي على نمو القوقعة ، والزخرفة الخلوية واتجاه خلايا الشعر ، وقراءات PCP. هدفنا هو تحليل إشارات PCP في قوقعة الفأر عن طريق تحليل النمط الظاهري والكيمياء المناعية والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

الزرد هو نظام نموذج العديد من الميزات القيمة بما في ذلك الوضوح البصري، التنمية الخارجية السريعة،، وأهمية خاصة في مجال السمع والتوازن، خارجياً يقع خلايا الشعر حسية. توضح هذه المقالة الزرد كيف المحورة وراثيا يمكن استخدامها للاعتداء ميتشانوسينسيشن خلايا الشعر والدالة بريسينابتيك بكاملها.

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا تجريبيًا لتقييم الخصائص المورفولوجية والحالة الوظيفية لمناصات المشبك الشريطية في الفئران العادية. النموذج الحالي هو أيضا مناسبة للنماذج التي تسببها الضوضاء والمرتبطة بالعمر cochlear متشابك المشبك. كما تتم مناقشة النتائج النسبية لدراسات الماوس السابقة.

التقييم المورفولوجي والوظيفي لمناصات الشريط في مناطق تردد محددة من القوقعة الماوس

هنا ، نقدم طريقة لتصور استيعاب 3 kDa تكساس الأحمر المسمى dextran في خلايا الشعر السمعية مع قنوات mechanotransduction وظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام dextrans من 3-10 كيلو دا لدراسة الخلايا الانبسية في الشعر والخلايا الداعمة لجهاز كورتي.

Dextran وضع العلامات والشراء في خلايا الشعر الحية والوظيفية Murine Cochlear

هنا نقدم بروتوكولا للتحقيق التنقل أيون التوصيل المجهر (HPICM)، وهي تقنية مسبار المسح الضوئي غير الاتصال الذي يسمح التصوير النانوي من حزم مجسمة في خلايا الشعر السمعية الحية.

Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

يتم تقديم بروتوكول لمعالجة قوقعة الجربيل لدى البالغين والمسنين عن طريق وضع العلامات المناعية على الهياكل المشبكية وخلايا الشعر ، وإخماد التألق الذاتي في الأنسجة القديمة ، وتشريح وتقدير طول القوقعة ، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي في أكوام الصور التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير البؤري.

الوسم المناعي والعد المشبك الشريطي في قوقعة الجربيل لدى الشباب والمسنين

الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

هنا ، نقدم بروتوكولا لنموذج الماوس لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL). للحث على NIHL ، قمنا بتطوير جهاز جديد وبسيط باستخدام البلاستيك المموج ، وقفص مصيدة الفئران ، ومكبر صوت. تم استخدام استجابة جذع الدماغ السمعية والتصوير المناعي لتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية ، على التوالي.

الظروف التجريبية المعدلة لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء في الفئران وتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية

استكشف تصوير القوقعة ثلاثي الأبعاد باستخدام المجهر الضوئي الصفحي لدراسة تغيرات الشيخوخة في الخلايا الشعاعية والعصبية الحلزونية. هذه الطريقة تتيح تحليلاً دقيقاً لصحة السمع دون تلف نسيجي.

تصوير قوقعة الشيخوخة باستخدام المجهر الفلوري ذو الصفيحة الضوئية

استكشف المزيد من الفيديوهات