تصوير قوقعة الشيخوخة باستخدام المجهر الفلوري ذو الصفيحة الضوئية

لقد طورنا مجهرا ضوئيا يمكنه رقمنة القوقعة بأكملها. يحتوي هذا المجهر على أهداف مثبتة بالهواء مع مسافة عمل طويلة يمكنها تصوير قوقعة فأر صغيرة تصل إلى عظم صدغي بشري كبير. يقوم بتقسيم القوقعة بشكل متسلسل باستخدام شعاع ليزر دون التسبب في أي تدمير ميكانيكي.

يمكن استخدام طريقة التصوير الخاصة بنا لتقييم التغيرات المرضية في قوقعة الأذن ، مثل فقدان خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية بسبب الشيخوخة. بعد القتل الرحيم وقطع رأس الفأر ، قم بعمل شق ظهري بطني عبر الدماغ لإصابة الجمجمة. إزالة الدماغ وتحديد الفقاعة المستديرة في الجزء القاعدي من الجمجمة.

فتح الفقاعة مع rongeurs. ثم تصور القوقعة وأزلها. تحت مجهر التشريح عند التكبير خمس مرات ، قم بثقب النافذة البيضاوية وإزالة الركابي باختيار حاد.

ثم أدخل معولا في النافذة المستديرة لثقب الغشاء. لإجراء التثبيت ، قم بتغطية النافذة المستديرة المفتوحة بالطرف المقطوع لمجموعة التسريب المرفقة بحقنة سعة ملليلتر واحدة مملوءة بملليلتر من الفورمالين. قم بضخ الفورمالين ببطء عبر المساحات المحيطة باللمفاوية للقوقعة على مدار دقيقتين، مع التأكد من خروج الفورمالين من القوقعة عبر النافذة البيضاوية المفتوحة.

تقليم الأنسجة الزائدة من القوقعة. اغمره في زجاجة تحتوي على 10٪ فورمالين وضعه على دوار طوال الليل. لإزالة الكلس ، شطف القوقعة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما.

اغمر في زجاجة تحتوي على محلول 10٪ من EDTA. احتضانها لمدة أربعة أيام مع الدوران ، وتغيير الحل يوميا. بعد ذلك ، قم برش القوقعة باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وانغمس لمدة 15 دقيقة بين التغييرات لإزالة كل EDTA.

بعد الغسيل ، قم بتجفيف القوقعة بتركيزات تصاعدية من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في كل تركيز. تلطيخ القوقعة بأكملها عن طريق الغمر في محلول رودامين ب طوال الليل مع الدوران. إزالة الصبغة الزائدة من القوقعة مع تغييرين من الإيثانول 100 ٪ مع الحضانة لمدة خمس دقائق لكل تغيير.

انقل القوقعة الملطخة إلى تغييرين من محلول Spalteholz لمدة 30 دقيقة في كل تغيير. اترك بين عشية وضحاها في حل المقاصة مع الدوران. قم بتوصيل القوقعة بقضيب عينة في نهاية غشاء النافذة البيضاوية والمستديرة.

تأكد من بقاء محلول المقاصة داخل القوقعة وعدم تكوين الفقاعات. قم بتوصيل نهايات النافذة البيضاوية والمستديرة للقوقعة الرطبة بقضيب العينة الجافة باستخدام غراء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية. عالج غراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 ثوان عن طريق التحرك حول القوقعة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

القوقعة في غرفة التصوير في خلية مقياس الكوارتز الفلورية الشفافة بصريا المملوءة بمحلول Spalteholz مع قضيب العينة المتصل بحامل دوار متصل أيضا بمرحلة ترجمة X / Z. بعد ذلك ، استخدم برنامجا مصمما خصيصا لتحريك العينة عبر ورقة الضوء في خطوات المحور X و Z وقم بعمل كومة من صور 2D في جميع أنحاء القوقعة. لمعالجة الصورة ، انقل مكدس الصور إلى كمبيوتر آخر وقم بتحميله في برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة البناء والقياس الكمي.

أظهر العرض المباشر لحجم قوقعة الفأر النوافذ البيضاوية والمستديرة ، وعضو كورتي بخلايا شعرية ، وتم تقسيم قناة روزنتال وحجمها ، وأظهرت الخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، أو SGNs ، على طولها. باستخدام TSLIM ، تم تصوير قوقعة فأر صغير يبلغ من العمر ثلاثة أشهر وفأر يبلغ من العمر 23 شهرا وحسابهما ل SGNs. أظهرت خلايا SGN كدالة لمسافة قناة روزنتال الموضحة في مخطط خطي SGNs أكبر في الحيوان الأصغر سنا في الأطراف الوسطى والقمية للقوقعة مقارنة بالحيوان الأكبر سنا.

تم تصور هذه الخسارة الواضحة لشبكات SGN باستخدام التحليل العنقودي وبرامج تقديم 3D. تم تصوير اختلافات كثافة SGN على مقياس ألوان حيث تكون المجموعات عالية الكثافة صفراء والأزرق يمثل مناطق أقل كثافة. يصور التحليل العنقودي بوضوح المناطق ذات الكثافة الخلوية المنخفضة على طول قناة روزنتال.

تم تصميم المجهر ورقة الضوء لإنتاج كومة محاذاة بشكل جيد من الصور التي يمكن من خلالها إنتاج عروض حجم 3D من الهياكل. تسمح برامج تقديم 3D بالتقييم الكمي للهياكل والعلاقات التشريحية بين الهياكل المختلفة. ومع ذلك ، نظرا لأن برامج تقديم 3D تقدم العديد من معلمات المستخدم المختلفة ، فهناك منحنى تعليمي كبير لاستخدام هذه البرامج بشكل فعال.