غرفة مرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع مجهر تشتت رامان المحفز

تتيح تقنية الغرفة البيئية المرنة الفاصل الزمني مثل تصوير SRS مع اكتشاف الإشارات المرسلة على إطار مجهر التشغيل. استخدم المجهر SRS هدفا عالي الفتحة العددية ومكثفا عالي النهاية ، تاركا فجوة بضعة ملليمترات فقط حيث لا يمكن للغرفة التقليدية أن تتلاءم. غرفة مرنة تحل هذه المشكلة.

يمكن للباحثين الذين يستخدمون الفحص المجهري SRS اعتماد هذه التقنية بسهولة. يمكن أيضا استخدام الغرفة المرنة على مجهر تشريح أو معقم للحفاظ على العينة في ظل الظروف الفسيولوجية المثلى. للبدء ، حدد مواقع أقدام إطار مجهر SRS والمرحلة الآلية باستخدام قلم تحديد على الطاولة البصرية.

بعد إزالة إطار المجهر والمرحلة من الطاولة البصرية ، ضع ورقة مطاط السيليكون على الطاولة. قطع مطاط السيليكون على طول العلامات باستخدام سكين. قم بإزالة القطع المطاطية الصغيرة ، وضع صفائح سيراميك الميكا المربعة في نفس الأماكن.

ثم حرك إطار المجهر والمسرح مرة أخرى إلى الطاولة البصرية وقم بمحاذاة القدمين بعناية على صفائح سيراميك الميكا على طول خطوط العلامة. بعد إعادة تنظيم المسار البصري SRS ، قم بتجميع العلبة البيئية أعلى أساس العزل الحراري لتغطية إطار المجهر بالكامل ، باستخدام خمس قطع من ألواح البولي كربونات الكبيرة. أغلق حواف وواجهات الصندوق باستخدام شريط رقائق الألومنيوم.

قم بتوصيل خرطوم مجرى الهواء المرن بمنافذ المدخل والمخرج لصندوق العلبة للسماح بتدفق الهواء الدافئ المتداول الذي يتم ضخه والتحكم فيه بواسطة وحدة السخان. قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 1 على قطعة مقدمة الهدف باستخدام ثلاثة براغي مجموعة. بعد ذلك ، قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 2 على حامل العينة باستخدام أربعة مسامير.

قم بتركيب حامل العينة بقطعة الألومنيوم 2 على المسرح الميكانيكي وقم بتركيبه باستخدام البراغي. ضع غلاف الفيلم المطاطي الطبيعي بين قطعتي الألمنيوم المشكل آليا وقم بتركيبه باستخدام الأربطة المطاطية في كل طرف. قم بتوصيل أسطوانة CO2 المضغوطة بوحدة خلط الغاز باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة.

اضبط ضغط إدخال CO2 على 20 إلى 25 رطل / بوصة مربعة. استخدم مستشعر CO2 المدمج ووحدة التحكم لضمان قدرة وحدة خلاط الهواء على تنظيم وخلط 5٪ CO2 في تدفق الهواء. استخدم المرشحات المضمنة لتنظيف تدفق الهواء.

باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة ، قم بتوجيه الهواء المختلط إلى زجاجة الماء المعقمة مسبقا الموضوعة على لوح التسخين ثم قم بتوجيه الهواء المرطب إلى الغرفة المرنة. اضبط لوح التسخين على 37 درجة مئوية. قم بفقاعة تدفق الهواء في الماء الدافئ لزيادة رطوبة تدفق الهواء.

افصل قطعة الألومنيوم 2 عن حامل العينة عن طريق إزالة البراغي. امسح جميع أجزاء الحجرة المرنة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، بما في ذلك قطعة الأنف وحامل العينة وهدف غمس الماء. قم بإزالة التلوث من نظام العلبة بالكامل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية الموضوع في العلبة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

ثم قم بتحميل طبق ثقافة الخلية. قم بإزالة غطاء الطبق وشل حركته باستخدام المشابك. خفض الهدف في وسائط زراعة الخلايا للتركيز الخشن.

اخفض قطعة الألومنيوم 2 لإحاطة الحجرة المرنة وتركيبها على حامل العينة باستخدام البراغي. ثم أدخل المستشعر. اضبط إمداد الهواء بنسبة 5٪ CO2 و 19٪ O2 لزراعة الخلايا الطبيعية بمعدل تدفق هواء يبلغ 200 سم مكعب في الدقيقة ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.

اضبط الطول الموجي لليزر على 805 نانومتر لاستهداف إزاحة رامان العكسية 2،854 سم ، والتي تعزى إلى اهتزاز الروابط الكيميائية CH2. استخدم طاقة ليزر منخفضة لتقليل تلف الصور للخلايا. اضبط الهدف وركز عليه لتحقيق تصوير SRS جيد للخلايا باستخدام زر التركيز الموجود على لوحة التحكم الرئيسية للبرنامج.

لإجراء التركيز البؤري السريع ، اضبط رقم البكسل على 512 × 512 بكسل مع وقت سكون بكسل يبلغ 4.8 ميكروثانية على لوحة التكوين. بعد تحقيق تركيز جيد ، اضبط دقة التصوير على 2048 × 2048 بكسل لمجال رؤية 175 ميكرومتر مربع للحصول على صور عالية الجودة. تحقق من وظيفة الحفظ في لوحة التحكم الرئيسية وتحقق من قناة SRS في لوحة القنوات.

اضبط الفاصل الزمني بين إطارين ليكون 180 ثانية على قناة عناصر التحكم الرئيسية. اضبط رقم الاستحواذ على 480 للتصوير بفاصل زمني على مدار 24 ساعة. ابدأ الحصول على التصوير الآلي باستخدام وظيفة الحلقة في لوحة التحكم الرئيسية.

تم تقييم أداء نظام الغرفة المرنة لتصوير SRS بفاصل زمني. وصلت درجة الحرارة داخل العلبة البيئية للمجهر إلى 37 درجة مئوية المتوقعة ولم تؤثر بشكل كبير على درجة حرارة الغرفة. وصلت درجة الحرارة في الغرفة المرنة إلى 37 درجة مئوية في 1.5 ساعة وتم الحفاظ عليها بثبات لمدة 24 ساعة على الأقل.

وصلت الرطوبة النسبية في الغرفة المرنة إلى 85٪ في ساعة واحدة ويمكن الحفاظ عليها لمدة 24 ساعة على الأقل. أظهر تصوير SRS بفاصل زمني لخلايا SKOV3 الحية الحركة السريعة والنشطة لقطرات الدهون داخل الخلايا بدقة زمنية مدتها ثلاث دقائق. بحلول نهاية جلسة التصوير التي استمرت 24 ساعة ، كانت الخلايا لا تزال تظهر مورفولوجيا وكثافة طبيعية ، مما يشير إلى أن الخلايا كانت سليمة.

بعد ذلك ، تم تصوير خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك وتم تتبع تراكم قطرات الدهون على مدار 10 ساعات. تم تحديد كميات قطرات الدهون باستخدام نسبة قطرات الدهون إلى مساحة جسم الخلية وكثافة SRS الكلية لقطرات الدهون. تشير النتائج إلى أن كمية قطرات الدهون استمرت في الزيادة على مدار 10 ساعات.

كما تم عرض تصوير SRS الأمامي المتزامن لقطرات الدهون والتصوير الفلوري للخلف الفوتون للجسيمات الحالة الموسومة بصبغة مضان DND-189. لوحظت درجة منخفضة جدا من التمركز المشترك لقطرات الدهون والليزوزومات. عند محاولة هذا البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن الانجراف البؤري يمثل مشكلة شائعة في تصوير الخلايا الحية.

قد تكون هناك حاجة إلى إعادة التركيز بعد حوالي ساعتين من التصوير بفاصل زمني. بعد تطويره ، تم استخدام تصوير SRS بفاصل زمني لدراسات مختلفة لتتبع الجزيئات الخالية من الملصقات أو الجزيئات المصنفة بنص رامان في الخلايا الحية.