الهندسة المجهرية 3D الكولاجين الهلاميات المائية مع محاذاة الألياف طويلة المدى

تسمح لنا هذه الطريقة بهندسة الهلاميات المائية للكولاجين 3D مع مستويات خاضعة للرقابة من محاذاة الألياف إلى البيئات النموذجية الموجودة في الأنسجة السليمة والمريضة في الجسم. توفر هذه التقنية نهجا بسيطا للسوائع الدقيقة لهندسة الهلاميات المائية الكولاجينية المحاذاة ، وإدخال الخلايا ، وتحديد كيفية تصرف الخلايا في بيئات 3D المحددة طبوغرافيا. سيوضح الإجراء نيل جوشي ومهران منصوري وآن بيرلي وجوستين فيداس لمختبري.

للبدء ، قم بتركيب ورقة PDMS بسمك 250 ميكرومتر على حامل بلاستيكي وقم بقص تصميم الموائع الدقيقة باستخدام قاطع حرفية على عمق شفرة يبلغ 0.5 ملم ، وسرعة سنتيمتر واحد في الثانية ، وقوة عالية. باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية ، قم بتنظيف قواطع قناة الموائع الدقيقة لمدة خمس دقائق. شطف القنوات الصوتية في الماء منزوع الأيونات وتجفيفها على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بتخزين القنوات في طبق بتري نظيف ومغطى حتى الاستخدام. لتصنيع طبقة غطاء PDMS وتشغيل السطح للتعديل المستقبلي ، قم بإعداد محلول 2٪ أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسيسيلان في دورق زجاجي عن طريق إضافة ملليلتر واحد من أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسيسيلان إلى 49 ملليلتر من الأسيتون. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول جلوتارالدهيد بنسبة 25٪ إلى 5٪ في الماء منزوع الأيونات.

اصنع ملليلتر من المحلول لكل 24 ملم × 50 ملم من انزلاق الغطاء. تنظيف زلات الغطاء في سونيكاتور الحمام لمدة خمس دقائق باستخدام IPA. اشطف IPA من زلات الغطاء باستخدام ماء منزوع الأيونات.

يشير فيلم الماء الناعم على قسيمة الغطاء إلى شطف IPA جيدا. جفف الغطاء ينزلق على طبق ساخن لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية. ضع الغطاء المجفف في أطباق بتري النظيفة ، مع التأكد من عدم تداخلها.

باستخدام عصا تفريغ الهالة ، قم بتعريض انزلاقات الغطاء لتفريغ الهالة لمدة دقيقة واحدة لكل منها. قم بإزالة زلات الغطاء في غضون خمس دقائق من التعرض للإكليل واغمر كل غطاء ينزلق في محلول أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسيسيلان لمدة 10 ثوان ، مع التأكد من غمر انزلاق الغطاء بعد ذلك ، قم بإزالة زلات الغطاء من محلول أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسيسيلان ، واغمرها في الأسيتون لمدة 10 ثوان ، وجففها بالهواء المضغوط. ضع الغطاء الجاف مرة أخرى في طبق بتري ، بحيث يكون الجانب المعالج متجها لأعلى.

ماصة ملليلتر واحد من محلول الجلوتارالدهيد على سطح كل زلة غطاء. قم بتغطية أكبر قدر ممكن من السطح دون السماح للمحلول بالانسكاب على حافة انزلاق الغطاء. اترك الغطاء ينزلق على اتصال بالمحلول لمدة 30 دقيقة ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 20 ثانية.

جفف انزلاقات الغطاء باستخدام الهواء المضغوط وضعها مرة أخرى في أطباق بتري ، الجانب المعالج بالبلازما لأعلى لقطع القاعدة المغناطيسية المعيارية بالليزر ، قم بقص التصميمات من طبقة PMMA باستخدام إعدادات الليزر المناسبة ، مثل عدد التمريرات والطاقة. يجب ضبط إعدادات الليزر بحيث يمكن تركيب المغناطيس بالضغط في طبقة PMMA. اغسل الجزء المقطوع بالليزر باستخدام الماء والصابون لإزالة الحطام من عملية القطع بالليزر.

لا تستخدم المذيبات ، لأنها قد تنشر الشقوق الدقيقة في الحواف المقطوعة بالليزر. لتجميع المنصة ، ادفع المغناطيس يدويا إلى القاعدة المقطوعة بالليزر. يجب أن يكون سمك المغناطيس أقل من سمك قاعدة PMMA لضمان تدفق المغناطيس مع سطح القاعدة.

انزع الجزء الخلفي من المادة اللاصقة الحساسة للضغط ، أو لوح PSA ، وقم بتوصيل القاعدة بغطاء معالج بالجلوتارالدهيد مع توجيه الجانب الوظيفي لأعلى. ضع فتحة قناة PDMS برفق في التجويف المحدد بواسطة الإطار. اضغط لأسفل باستخدام ملاقط عريضة الطرف لإزالة فقاعات الهواء وضمان الاتصال المطابق.

ضع ألبومين مصل الأبقار ، أو غطاء القناة المعالج ب BSA أعلى فتحة القناة بحيث يكون جانب BSA متجها لأسفل. تأكد من محاذاة منافذ مدخل ومخرج السوائل مع القناة. الجهاز جاهز لحقن الكولاجين I.

ضع مضخة حقنة ، وحقنة معقمة مبردة ، ومحلول كولاجين مبرد من النوع الأول ، وإبرة قفل معقمة بزاوية 20 درجة بزاوية 90 درجة في خزانة السلامة البيولوجية. قم بتحميل محلول الكولاجين I في المحقنة ، وتجنب الفقاعات. قم بتوصيل طرف الإبرة بالمحقنة ، وقم بتحميل المحقنة في مضخة المحقنة ، والإبرة متجهة لأسفل ، وقم بتجهيز الإبرة بمحلول الكولاجين I.

اضبط مضخة المحقنة على معدل التدفق المطلوب بين 50 إلى 2،000 ميكرولتر في الدقيقة. ضع قنوات PDMS المحضرة على مقبس المختبر وقم بتسويتها بالإبرة. أدخل الإبرة في منفذ مدخل قناة PDMS.

قم بحقن القناة حتى يتم جمع قطرة 30 ميكرولتر من الكولاجين I على جانب المخرج. اخفض مقبس المختبر وافصل الإبرة برفق عن القناة المملوءة حديثا. كرر حتى تمتلئ جميع القنوات بمحلول الكولاجين I.

قم بتحميل القنوات المملوءة في أطباق بتري جنبا إلى جنب مع مناديل نظيفة وخالية من النسالة مشبعة بالماء منزوع الأيونات لمنع جفاف جل الكولاجين I المتشكل حديثا. غطي طبق بتري وضع القنوات المحملة في الحاضنة لمدة ساعتين قبل خطوة التقشير. للتقشير وتوازن الوسائط ، ابدأ برفع غطاء PDMS باستخدام ملاقط لكشف الكولاجين المبلمر I Gel.

أضف 650 ميكرولتر من وسائط النمو البطانية إلى البئر. بدلا من ذلك ، قم بتوصيل وحدة أخرى لإدخال طبقة كولاجين إضافية أو توفير إمكانات نضح الوسائط. اترك الأجهزة في الحاضنة لمدة لا تقل عن أربع ساعات لموازنة الجل والوسائط.

استبدل الوسائط قبل البذر بالخلايا. إن تشغيل الغطاء الزجاجي الذي مكن من الانزلاق في رفع القناة وتشغيل غطاء PDMS مع BSA منع ارتباط الكولاجين I. ظلت محاذاة ألياف الكولاجين I غير متأثرة بعد رفع الغطاء.

أظهرت صور HUVECs المستزرعة على الجزء المحاذي من المصفوفة زيادة محاذاة ألياف الأكتين مقارنة ب HUVECs على الجزء ذي الألياف العشوائية. يسمح لنا نهجنا بنمذجة البيئة المكروية للورم وتحديد كيفية استجابة أنواع الخلايا المختلفة. يمكننا أيضا تقديم قنوات التدفق لدعم التجارب طويلة المدى.