استخلاص اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي وتحديد درجة حرارة تخزينه
أكتوبر 14, 2022
يصف البروتوكول الحالي استخراج اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي (AM) وظروف تخزينه كمستخلص AM (AME) عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما لتحديد بروتيناته وتركيز اللوميكان.
تهدف هذه الطريقة إلى إظهار تقنية مباشرة لاستخراج البروتين ، مفيدة للحصول على البروتينات الوفيرة وعوامل أخرى. يمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج العوامل والبروتينات الأخرى الموجودة في الغشاء الأمنيوسي وأيضا للحصول على البروتينات من مصادر أخرى مثل الحيوانات والأنسجة النباتية. ابدأ بإذابة 100 ملليغرام من الغشاء الأمنيوسي الذي تم الحصول عليه من بنك السلى.
بمجرد إذابة الجليد ، أضف 10 ملليلتر من محلول الملح المتوازن المعقم إلى طبق بتري واغسل الغشاء لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الملح المتوازن المستخدم في دورق وكرر العملية حتى لا يظهر أي أثر لوسط الجلسرين في طبق بتري. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من dispase II إلى الغشاء واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، قم بإجراء إزالة الظهارة الميكانيكية باستخدام مكشطة خلية شرطي مطاطية. بعد ذلك ، تصور الغشاء تحت مجهر مقلوب لتأكيد إزالة الاندمال الظهاري. بعد ذلك ، اغسل الغشاء الأمنيوسي غير الظهاري بمحلول الملح المتوازن المعقم كما هو موضح سابقا ، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر.
ثم اغمر الأنبوب الذي يحتوي على الغشاء في النيتروجين السائل لمدة 40 دقيقة. بعد التجميد باستخدام النيتروجين السائل ، قم بطحن الغشاء يدويا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في ملاط ، مبرد مسبقا عند 85 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم. بعد ذلك ، أضف 2.5 ملليلتر من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني وقم بإذابة الغشاء المسحوق ناعما.
قم بتنظيف جدران الهاون بمساعدة سكين مشرط ونقل الخليط إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بتجانس خليط الأنسجة عن طريق الطرد المركزي أولا عند 34 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بالطرد المركزي على الفور مرة أخرى عند 3،360 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
في نهاية الطرد المركزي ، اجمع الطافي ، وهو مستخلص الغشاء الأمنيوسي ، في أنبوب جديد. بعد ذلك ، حاصل على 0.7 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مختلف سعة 2 ملليلتر لنقاط زمنية ودرجات حرارة مختلفة. تأثرت كمية البروتين الكلية وتركيز اللوميكان في مستخلص الغشاء الأمنيوسي بالوقت وظروف التخزين.
كان تركيز البروتين القاعدي مشابها بين جميع مستخلصات الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، لوحظ تركيز بروتين مرتفع بشكل ملحوظ في المستخلص المخزن لمدة 32 يوما عند أربع درجات مئوية و 20 يوما عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. كان اللوميكان في مستخلص الغشاء الأمنيوسي أعلى بشكل ملحوظ في العينة المخزنة لمدة 12 يوما مقارنة بالعينات المخزنة لمدة 30 و 20 وستة أيام عند أربعة و 20 درجة مئوية تحت الصفر.
اقترحت هذه النتائج أن وقت التخزين ودرجة الحرارة المناسبين لتحقيق أعلى تركيز للوميكان هو 12 يوما عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. مارس أقصى درجات الحذر أثناء تأريض الغشاء الأمنيوسي المجمد. يجب أن يكون التأريض لطيفا لأنه قد يسقط من الهاون.
هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد دور مستخلص الغشاء الأمنيوسي lumican في الخلايا الظهارية القرنية وتحديد الجرعة المثالية من lumican لإعادة الاندمال الظهاري للقرنية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لاستخلاص البروتين اللوميكان (lumican) من الغشاء السلوي (AM) وتخزينه تحت ظروف متنوعة. وتقوم الدراسة بتحديد كمية البروتين وتركيز اللوميكان عبر فترات زمنية مختلفة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- يعد لوميكان (Lumican) بروتيوجليكان يشارك في عمليات بيولوجية متنوعة.
- يُعتبر الغشاء السلوي مصدراً غنياً بالبروتينات والعوامل.
- إن فهم ظروف التخزين أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة البروتين.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لتُطبق على أنسجة بيولوجية أخرى.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول استخلاص موثوق لبروتين lumican.
- تقييم آثار ظروف التخزين المختلفة على استقرار lumican.
- توفير طريقة أساسية لاستخلاص البروتين من الأغشية البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- إذابة عينات الغشاء السلوي.
- غسل الغشاء بمحلول ملحي متوازن معقم.
- الحضن باستخدام dispase II لاستخلاص البروتين.
- تخزين مستخلص AM في درجات حرارة مختلفة للتحليل.
النتائج الرئيسية
- الاستخلاص الناجح لبروتين lumican من الغشاء السلوي.
- تقدير تركيز البروتين تحت ظروف تخزين مختلفة.
- تتفاوت استقرارية lumican بتفاوت درجة الحرارة والزمن.
- يمكن تطويع هذا البروتوكول لاستخلاص بروتينات أخرى من مصادر مختلفة.
الاستنتاجات
- تعد طريقة الاستخلاص هذه فعالة في الحصول على بروتين lumican.
- تؤثر ظروف التخزين بشكل كبير على استقرار البروتين.
- يمكن لهذا البروتوكول تسهيل المزيد من الأبحاث حول بروتينات الغشاء السلوي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
إن الاستخلاص والتقدير الكمي الموثوق لبروتين lumican من الغشاء السلوي البشري يتيح وصولاً معيارياً إلى مكون مصفوفة نشط بيولوجياً ذي أهمية محتملة لأبحاث إصلاح الأنسجة والعين. كما أن فهم استقرار lumican في ظل ظروف تخزين محددة يدعم سير العمل القابل للتكرار ويوجه قرارات المعالجة الحيوية للتطبيقات الانتقالية. ويضع هذا البروتوكول استخلاص lumican كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام في مراحل البحث والتطوير المبكرة للصيدلة الحيوية وتطوير المواد الحيوية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكّن من استقصاء الدور البيولوجي لبروتين lumican في تنظيم المصفوفة خارج الخلية وعملية التظهير.
- يدعم التحقق الوظيفي من lumican كمرشح لأبحاث الطب التجديدي.
- يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال توفير تحضيرات قياسية من lumican للدراسات المختبرية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مصدراً قابلاً للتكرار لبروتين lumican لمعايرة المقايسة وفحص المركبات.
- يتيح التقييم الكمي لتركيز lumican تحت ظروف تخزين محكومة.
- يدعم توحيد معايير المقايسة من خلال تحديد المعايير المثلى للاستخلاص والتخزين.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوفر مستخلصات غنية ببروتين lumican للتقييم قبل السريري في النماذج ذات الصلة بأمراض إصلاح القرنية.
- يتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على سلامة البروتين عبر فترات التخزين.
- يدعم قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال توضيح ملفات استقرار lumican.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يتناسب بروتوكول الاستخلاص والتقدير الكمي هذا مع السلسلة الممتدة من مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى المرحلة قبل السريرية، مما يدعم كل من الأبحاث القائمة على الفرضيات وتطوير المواد الحيوية الانتقالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: توفر منصة لاختبار التأثيرات الميكانيكية لبروتين lumican على سلوك الخلايا وتجميع المصفوفة.
- الفحص: توفر تحضيرات معيارية من lumican لتطوير مقايسات قابلة للتكرار وتقييم المركبات.
- التحليلات: تتيح القياس الكمي لتركيز lumican لمقارنة ظروف التخزين وتحسين تدفقات العمل.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على سلامة المستخلص للدراسات قبل السريرية اللاحقة في نماذج إصلاح الأنسجة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع بروتوكولاً قابلاً للتطبيق على عمليات استخلاص البروتينات الأخرى من الأغشية البيولوجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في الدور الوظيفي واستقرار lumican.
- القيمة التشغيلية: توحد عمليات الاستخلاص والتخزين، مما يحسن من قابلية التكرار وقابلية التوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تسترشد بها قرارات المضي قدماً أو التوقف في برامج المواد الحيوية والطب التجديدي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمبادرات البحث والتطوير القائمة على lumican.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات استخلاص البروتين وتقديره كمياً.
- يستلزم الوصول إلى وحدات التخزين المبرد، وأجهزة الطرد المركزي، وكواشف مثبطات البروتياز.
- يتطلب توحيداً قياسياً لبروتوكولات الاستخلاص والتخزين بين الفرق المختلفة.
- يمكن تكييف الطريقة مع مصادر أنسجة أخرى من خلال تحسين البروتوكول.
- من الضروري التعامل بحذر أثناء عملية الطحن لمنع فقدان العينات، كما هو موضح في البروتوكول.
