فحص عالي المحتوى لتحديد المركبات المعدلة للسمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة

يمكن التوسط في السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، أو ADCC باختصار ، بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية ، والتي نشير إليها باسم الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المحببة والبلاعم. هذه هي الخلايا المستجيبة ل ADCC. إذا ارتبط جسم مضاد مثل تراستوزوماب ، الذي يستهدف مستقبل عامل نمو البشرة ، HER2 ، بالخلايا السرطانية ، فإن هذه الخلايا المستجيبة تستخدم مستقبلات FcyR الخاصة بها لربط منطقة FC الثابتة للأجسام المضادة.

يربط الجسم المضاد الخلايا السرطانية والخلايا المستجيبة الحاملة للمستقبلات FcyR ، مما يؤدي إلى إطلاق حبيباتها السامة للخلايا. هذا يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية. قد يكون ADCC فعالا ضد الأورام التي لا تستجيب للتأثيرات المضادة للتكاثر للتراستوزوماب.

لإعداد نظام ADCC ، نحتاج إلى المشاركة في احتضان خلايا سرطان الثدي JIMT-1 الإيجابية المضادة ل HER2 مع خط خلايا NK-92 في وجود تراستوزوماب الأجسام المضادة ل HER2. يعبر خط خلايا JIMT-1 الذي نستخدمه للفحص بثبات عن بروتين الفلورسنت الأخضر. أولا ، قم بترميز لوحة الغربلة عالية المحتوى المكونة من 96 بئرا باستخدام وسيط JIMT.

ماصة 50 ميكرولتر من المتوسطة في كل بئر من لوحة. ضع اللوحة في حاضنة CO2 لمدة ساعة واحدة. الطلاء أمر بالغ الأهمية لربط خلايا JIMT-1 بالسطح الزجاجي للوحة.

أثناء خطوة الطلاء ، يقوم التربسين بإنتاج خلايا JIMT-1. اغسل الخلايا بمليلتر من برنامج تلفزيوني معقم. ثم أضف ملليلترا واحدا من Trypsin-EDTA إلى الدورق.

ضع القارورة مرة أخرى في حاضنة CO2 لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، انقر فوق القارورة للتحقق مما إذا كانت خلايا JIMT-1 قد انفصلت. أوقف عملية الهضم باستخدام ملليلتر من وسائط JIMT-1 واجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلتر.

ثم عد خلايا JIMT-1 ذات اللون الأزرق المثقب في غرفة مصبوبة زرقاء. اضبط رقم الخلية على 133،000 خلية لكل مل. نضح وسط الطلاء ، ثم أضف 75 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر.

اسمح للخلايا بالالتصاق أثناء الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2. في اليوم التالي ، قم باستنشاق الوسيط وإضافة 50 ميكرولتر من وسط JIMT-1 الطازج إلى الآبار ، ونقل اللوحة إلى مختبر الفحص عالي الإنتاجية. يستخدم الروبوت لنقل مركبات الاختبار إلى الصفائح الدقيقة للفحص عالية المحتوى.

باستخدام الذراع الروبوتية ، يمسك الروبوت بوحدة أداة الدبوس ، والتي تمت معايرتها لنقل 25 نانولتر. نقل ما مجموعه 100 نانولتر من مركبات الاختبار من لوحة المكتبة المركبة إلى لوحة الفحص في أربع خطوات. تأكد من أن التركيز النهائي لمركبات الاختبار هو 20 ميكرومولار.

بين كل خطوة ، أولا ، اغسل أداة الدبوس في 50٪ DMSO ، ثم في 70٪ إيثانول. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية. زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية في قوارير زراعة الأنسجة T25.

أثناء استمرار العلاج الدوائي لخلايا JIMT-1 ، اجمع الخلايا القاتلة الطبيعية من قارورة T25 إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. عد خلايا NK-92 ذات اللون الأزرق المثقب في غرفة العد الزرقاء. اضبط رقم الخلية على 400،000 خلية لكل مل.

أجهزة الطرد المركزي حجم تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية الذي يحتوي على 400،000 خلية لكل مل عند 150 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد وسط ADCC عن طريق إضافة 20 ميكروغرام لكل مل من الأجسام المضادة ل HER2 تراستوزوماب إلى وسط JIMT-1. ماصة 20،000 خلية NK في وسط ADCC سعة 50 ميكرولتر إلى خلايا JIMT-1 GFP المستهدفة.

الحجم النهائي هو 100 ميكرولتر ، وتركيز تراستوزوماب النهائي هو 10 ميكروغرام لكل مل. ضع لوحة الفحص في معدات تحليل المحتوى العالي ، والتي تحتوي على حاضنة مدمجة 37 درجة مئوية. يتم تصوير اللوحات في نقطتين زمنيتين.

أولا ، نحصل على الصور مباشرة بعد إضافة الخلايا المستجيبة إلى الخلايا المستهدفة ، ويتم التقاط المجموعة الثانية من الصور بعد ثلاث ساعات من إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية. أولا ، حدد نوع الصفيحة الدقيقة. استخدم 96 لوحة فحص عالية المحتوى.

حدد لاختيار التركيز لأن الفحص يتم في لوحات ذات هدف 10x في الوضع غير البؤري. اختر تجميع اثنين لمضاعفة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. حدد القنوات المناسبة ووقت التعرض وطاقة الليزر ومستوى التركيز والطول الموجي.

التقط صور برايت فيلد عند 650-760 نانومتر واكتشف خلايا JIMT-1 المحولة ب EGFP بإثارة 488 نانومتر وطول موجة انبعاث 500-550 نانومتر. قبل بدء القياس ، التقط عينات من الصور باستخدام وظيفة اللقطة للتحقق من الإعدادات الصحيحة. أخيرا ، قم بتعيين عدد الحقول وعدد النقاط الزمنية للتصوير.

اختر ، على سبيل المثال ، تسعة حقول ونقطتين زمنيتين. لتحليل كفاءة ADCC ، عد خلايا JIMT-1 القابلة للحياة في بئر التحكم ADCC. استخدم وحدة الخلايا الدقيقة لاكتشاف المناطق على الصورة التي تتوافق مع الخلايا.

اكتشف كل خلية كمنطقة على الصورة ذات كثافة مضان أعلى من محيطها. حدد الخلايا باستخدام خوارزمية M المدمجة بقطر 80 ميكرومتر. اضبط إعداد حساسية التقسيم، الذي يقسم كائنا كبيرا إلى كائنات أصغر، على القيمة 0.5.

اضبط الحد الشائع، وهو أدنى مستوى لكثافة البكسل، على الصفر. استبعد اكتشاف منطقة الخلفية ذات الكثافة الفلورية العالية EGFP في خطوتين. أولا ، قم بتطبيق دالة حساب خصائص الكثافة لتحديد شدة مضان EGFP في منطقة الخلايا المحددة مسبقا.

بعد ذلك ، قم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للكثافة باستخدام خيار تحديد المحتوى ، بحيث نحصل على عدد الخلايا المستهدفة JIMT-1 GFP القابلة للتطبيق في نهاية ADCC. احسب كفاءة ADCC بقسمة رقم الخلية المكتشف بعد ثلاث ساعات على رقم الخلية المكتشف في الوقت صفر. نود أن نوضح التطبيق العملي لطريقتنا بنتائج تمثيلية.

لقد أنشأنا لوحة اختبار تحتوي على 16 مركبا تم إزالتها عشوائيا من الرفوف. قمنا أيضا بتضمين ثلاثة مركبات ، كولشيسين ، فينكريستين ، وبودوفيلوتوكسين مع تأثير مثبط متوقع ل ADCC. تم استخدام DMSO كعنصر تحكم سلبي.

تم استخدام كل دواء في أربعة تكرارات على اللوحة. يوضح الشكل نتيجة شاشة الاختبار. في مجموعة ناقص NK ، تم اختبار سمية الأدوية على خلايا JIMT-1.

في مجموعة NK زائد ، تمت إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية و trastuzumab ، مما تسبب في حوالي 50 ٪ من السمية الخلوية. يمكن الكشف عن التأثير المثبط المتوقع ل ADCC لمركبات الاختبار الثلاثة باستخدام الفحص. لقد أنشأنا نظام فحص الثقافة المشتركة لنمذجة التفاعل ذي الصلة سريريا بين خلايا سرطان الثدي والخلايا القاتلة الطبيعية والجسم المضاد أحادي النسيلة العلاجي تراستوزوماب.

يعتمد الفحص على الفحص المجهري الآلي جنبا إلى جنب مع تحليل الصور وهو مناسب لفحص مكتبات المركبات الكيميائية لتحديد الأدوية المعدلة ل ADCC. يمكن استخدام الإجراء لتحديد الجزيئات المساعدة التي تحفز استجابة مضادة للأورام أو لتحديد المواد الكيميائية ذات التأثير الضار.