تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae

يسمح هذا البروتوكول بتحديد دقيق لمدة المرحلة S في خلايا الخميرة الناشئة المتزامنة. إنها طريقة سريعة وسهلة وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، فهي حساسة بما يكفي للكشف عن عيوب التوليف الخفيفة التي لم تكتشفها البروتوكولات الكلاسيكية.

ستكون هذه الطريقة مفيدة للعديد من الباحثين الذين يعملون على تنظيم دورة الخلية في الخميرة الناشئة. سيوضح هذا البروتوكول نيكولاس تالاريك ، باحث أول ، وخوان دي ديوس باربا تينا ، طالب دكتوراه في المختبر. تلقيح خلايا Saccharomyces cerevisiae في 10 ملليلتر من وسط SC بتركيز خلية منخفض لثقافة ليلية عند 30 درجة مئوية مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا في 20 ملليلتر من وسط SC الطازج بتركيز نهائي من اثنين إلى ثلاثة في 10 أس ست خلايا لكل ملليلتر. في 40 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر عامل ألفا مخفف في الماء. ثم استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية ، مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة.

كرر هذه الخطوة مرة واحدة. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي لمراقبة اعتقال G1. تابع إذا كان أكثر من 90٪ من الخلايا تعرض shmoo ، والأخرى عبارة عن خلايا مستديرة غير منطوحة.

أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة ثلاث دقائق في 1،500 G.ثم تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة الفراغ وأعد تعليق الخلايا في 20 ملليلتر من وسط SC. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. اجمع ملليلترا واحدا من الخلايا مرتين كل خمس دقائق وانتقل إلى وضع العلامات على EDU.

أضف 400 ميكرولتر من عامل ألفا بعد 30 دقيقة من الإصدار. نقل واحد ملليلتر من ثقافة الخلية إلى أنبوب microfuge 2 ملليلتر يحتوي على ميكرولتر واحد من 10 ملليمولار EDU ، مختلطة جيدا عن طريق الانقلاب. لتمييز الخلايا الموجبة EDU عن الخلايا السالبة EDU على حقائق Pi EDU ثنائية المتغير ، قم بنقل ملليلتر آخر من زراعة الخلايا إلى أنبوب microfuge سعة 2 ملليلتر يحتوي على ميكرولتر واحد من DMSO.

احتضان لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 30 درجة مئوية تحت التحريض في حمام مائي يهتز. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. بيليه الخلايا لمدة دقيقتين في 10،000 غرام في microfuge.

قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مفرغة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. اترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل بمعدل 20 إمالة في الدقيقة على هزاز متغير السرعة لاختراق الخلايا.

بيليه الخلايا لمدة دقيقتين في 10،000 غرام في جهاز طرد مركزي دقيق وتجاهل الطافي مع ماصة فراغ. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ و PBS. بيليه الخلايا لمدة دقيقتين في 10،000 غرام في microfuge وتجاهل الطاف مع ماصة فراغ.

أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على RNase A و Proteinase K.احتضان من ساعة إلى ساعتين عند 50 درجة مئوية مع اهتزاز عرضي ، أو طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بيليه الخلايا لمدة دقيقتين في 10،000 G في جهاز طرد مركزي صغير وتجاهل الطافي مع ماصة فراغ. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

ثم قم بتكوير الخلايا وتجاهل المادة الطافية كما هو موضح سابقا. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS مع 1٪ BSA. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتكوير الخلايا ، وتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ BSA. توزيع الخلايا في اثنين ، 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. يجب أن يتكون الأنبوب الأول من 200 ميكرولتر من زراعة الخلايا لتفاعل النقر ، ويجب أن يحتوي الأنبوب الثاني على 100 ميكرولتر من زراعة الخلايا لتلطيخ السيتوكس الأخضر.

ثم, بيلة الخلايا وتجاهل الطافي كما هو موضح سابقا. لتلطيخ sytox الأخضر, إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من PBS. ثم اعتمادا على تركيز الخلية ، انقل 10 إلى 30 ميكرولتر إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من خليط sytox الأخضر.

قم بتقطيع العينات مرتين لمدة ثانيتين بسعة 40 إلى 50٪ اتركيه في الظلام حتى تتم معالجة العينات على مقياس التدفق الخلوي. لتفاعل النقر, أعد تعليق حبيبات الخلية ب 40 ميكرولتر من محلول صبغة Azide الطازج. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 60 دقيقة.

قم بتكوير الخلايا وتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 50 ميكروغرام لكل ملليلتر يوديد البروبيديوم في برنامج تلفزيوني واتركه لمدة 10 دقائق في الظلام.

اعتمادا على تركيز الخلية ، انقل 10 إلى 30 ميكرولتر من معلق الخلية إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من 50 مليمولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 7.5. Sonicate مرتين لمدة ثانيتين بسعة 40 إلى 50. اترك العينات في الظلام حتى معالجتها على مقياس خلوي.

اقرأ العينات الخضراء sytox باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ، ومرشح تمرير نطاق 530 × 30. اقرأ عينات Bavaria Pi EDU على مخطط نقطي باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ومرشح تمرير نطاق 615 × 20 لمحور Pi X ، وليزر إثارة أحمر عند 640 نانومتر ، ومرشح تمرير نطاق 660 × 20 للمحور Y. لوحظت ثلاث مجموعات من الخلايا في تحليل مقياس الخلايا EDU Pi ثنائي المتغير.

عند 25 درجة مئوية ، كان ما يقرب من 27٪ من سكان الخلايا في المرحلة G1 ، و 29٪ في المرحلة S ، وحوالي 44٪ في المرحلة G2 زائد M. في الخلايا المتزامنة ، قد تكون مدة المرحلة S حوالي 25 دقيقة بناء على الوقت الذي تغير فيه محتوى الحمض النووي من C واحد إلى اثنين C على ملف تعريف مقياس التدفق الخلوي الأخضر sytox. حدد وضع العلامات النبضية EDU بدقة مدة المرحلة S.

بعد 15 دقيقة من الإصدار ، تم اكتشاف جزء من الخلايا الإيجابية EDU ، مما يشير إلى بداية المرحلة S. شوهد التقدم خلال المرحلة S من خلال سحابة الخلية تتحرك لأعلى ولليمين في الرسم البياني Bavaria Pi EDU. أخيرا ، في 35 دقيقة من الإطلاق ، كان جزء من الخلايا سلبيا ل EDU ، ولكن مع ضعف كمية الحمض النووي التي تشير إلى أن المرحلة S انتهت وأن الخلايا كانت في المرحلة G2 plus M.

على الرغم من التزامن العالي الذي لوحظ ، أنهت بعض الخلايا المرحلة S بعد 60 دقيقة من الإطلاق واكتملت المرحلة S لجميع السكان بعد حوالي 65 دقيقة من الإطلاق. من الأهمية بمكان الحصول على مزامنة مثالية ومنع الخلايا من دخول المرحلة S الثانية. يمكن تصوير الخلايا باستخدام المجهر حيث يمكن مراقبة استبصار تكرار الحمض النووي وقياسه كميا.

ستساعد هذه التقنية في تحديد الطفرات التي يتم التغاضي عنها والتي تحتوي على عيوب خفيفة في المرحلة S ، بالإضافة إلى عيوب مدة دورة الخلية.