Name: طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: تعلم طريقة الطرد المركزي التفاضلي المحسّنة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من أنسجة سرطان الكبد بدرجة نقاء أعلى من الطرق التقليدية. هذه التقنية البسيطة تدعم أبحاث الأحياء السرطانية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية على دعم هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 82260422).

تم جمع أنسجة سرطان الكبد البشري من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالأورام الخبيثة الكبدية في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. وقع جميع المرضى على نموذج موافقة مستنيرة ، وتمت الموافقة على جمع عينات الأنسجة البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. التحضير
<ol><li>ضع شاكر إزالة اللون في الحاضنة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. انظر الشكل 1 لجميع المعدات الأخرى المطلوبة.</li>
	<li>نظف المشرط والملقط عن طريق رشها بنسبة 75٪ كحول.</li>
	<li>تحضير محلول الهضم عن طريق قياس 6 ملغ من كولاجيناز D (4 ملغ / مل) و 24 ميكرولتر من DNase Ι (80 وحدة / مل) وإضافتها إلى 1.5 مل من الوسط الأساسي RPMI-1640. تخلط عن طريق انقلاب لطيف حتى تذوب المواد المضافة تماما.</li>
	<li>مقدما ، رطب مصافي الخلايا 70 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).</li>
	<li>ضع طبق زراعة خلايا معقمة 100 مم على صندوق الثلج لتثبيت أنسجة الكبد بعد إذابة الجليد.</li>
	<li>في غضون 15 دقيقة بعد عزل أنسجة سرطان الخلايا الكبدية ، شطف الدم على سطح كتلة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني ، ونقل الأنسجة إلى أنبوب مجمد معقم ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التجربة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.</li>
</ol>2. تفكك الأنسجة
<ol><li>أخرج عينة الأنسجة من الفريزر -80 درجة مئوية وضع حوالي 400 مجم من الأنسجة المقطعة إلى شظايا 2 مم × 2 مم × 2 مم - في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج.</li>
	<li>نقل الأنسجة إلى لوحة 6 آبار مع 1.5 مل من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون (20 دورة في الدقيقة / دقيقة) لاحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق sEVs.</li>
	<li>أخرج اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة وضعها على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولتر من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبط الأنزيم البروتيني الكامل لوقف عملية الهضم.</li>
	<li>انقل المحلول الهضمي إلى مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي بقايا أنسجة كبيرة. اجمع المرشح وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.</li>
</ol>3. الطرد المركزي التفاضلي
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.
<ol><li>أجهزة الطرد المركزي المرشح في 500 × غرام لمدة 10 دقائق وجمع طاف في أنبوب طرد مركزي جديد 2 مل. يمكن بعد ذلك إزالة معظم بقايا الأنسجة الصغيرة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي على متن المادة الطافية عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يصبح طرف الماصة على وشك لمس المادة البيضاء على السطح.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي السائل المتبقي عند 3000 × جم لمدة 3 دقائق ؛ ثم ، نضح الطافي لتسهيل جمع الحويصلات. لضمان نقاء sEVs ، تأكد من عدم استنشاق المادة البيضاء.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة ونقل 900 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 4.7 مل. قم بطرد السائل المتبقي عند 12000 × جم لمدة 3 دقائق ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق. املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي للطاف في 100000 × غرام لمدة 60 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS والطرد المركزي مرة أخرى عند 100000 × جم لمدة 60 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS.</li>
	<li>نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة 1 مل وترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.</li>
</ol>4. تقييم جودة التخصيب
<ol><li>مراقبة مورفولوجيا sEVs تحت المجهر الإلكتروني الإرسال.<ol><li>بعد ذلك ، قم بإسقاط 10 ميكرولتر من عينة sEV على شبكة نحاسية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وتنظيفها بالماء المقطر المعقم ، باستخدام ورق ماص لإزالة السائل الزائد.</li>
		<li>قم بإسقاط 10 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل 2٪ على شبكة النحاس للتلطيخ السلبي لمدة دقيقة واحدة. استخدم ورق الترشيح لامتصاص السائل الموجود على سطح الشبكة النحاسية وتجفيفه لمدة 2 دقيقة تحت مصباح متوهج.</li>
		<li>راقب الشبكة النحاسية تحت المجهر الإلكتروني النافذ والصورة عند 80 كيلو فولت.</li>
	</ol></li>
	<li>استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs.<ol><li>قبل بدء تشغيل الماكينة ، قم بإعداد أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر من مراقبة الجودة ، و 200 ميكرولتر من الكريات النانوية السيليكا ، و 2 × 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 × 200 ميكرولتر من محلول التنظيف ، و 200 ميكرولتر من PBS. ملاحظة: قبل اختبار عينات sEV ، من الضروري إجراء مراقبة الجودة على الجهاز واختبار معيار حجم الجسيمات (يجب حساب توزيع الحجم باستخدام منحنيات قياسية تم إنشاؤها باستخدام عدة كرات نانوية دقيقة بأقطار مختلفة [68-155 نانومتر] تحت نفس حالة الكشف). تم تخفيف حبات مراقبة الجودة والكريات النانوية السيليكا 100x بماء فائق النقاء بحجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر.</li>
		<li>تحقق من حجم محلول التنظيف (>10 مل) ولاحظ الفرق بين مستويات سائل الغمد وسائل النفايات (20-30 سم).</li>
		<li>قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ؛ بعد 20 ثانية ، قم بتشغيل الكمبيوتر وانتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج.</li>
		<li>انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.</li>
		<li>انقر فوق غمد التدفق - بدء التشغيل ، وضع الماء عالي النقاء على منصة التحميل. بعد 4 دقائق (العد التنازلي للأداة) ، انقر فوق تعزيز العينة | عينة تفريغ.</li>
		<li>بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة | عينة تفريغ. بعد ذلك ، ضع الأنبوب الذي يحمل الماء عالي النقاء على منصة التحميل ، وفي نفس الوقت ، انقر فوق تعزيز العينة | غمد التدفق تطهير.</li>
		<li>انقر فوق التشغيل اليدوي وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة وحدد في نفس الوقت 250 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. إنف."</li>
		<li>انقر فوق أخذ العينات وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM. ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية شكل موجة الإشارة في الوقت الفعلي.</li>
		<li>انقر فوق أخذ العينات التلقائي وأدخل 1.0 في Sampling SET لإصلاح الضغط عند 1 كيلو باسكال. انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة كبيرة.</li>
		<li>اضبط الوضع الأفقي لليزر واضبط الليزر على 2 ميكرومتر ؛ ثم ، انقر فوق L أو R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة.</li>
		<li>انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.</li>
		<li>ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وبعد 1 دقيقة ، انقر فوق تفريغ العينة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.</li>
		<li>ضع الأنبوب القياسي بحجم الجسيمات على منصة التحميل وانقر على تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.</li>
		<li>انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.</li>
		<li>ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة ، وانقر فوق تفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.</li>
		<li>ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ؛ انقر فوق تعزيز العينة لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>حدد 68-155 نانومتر Std FL SiNPs مراقبة الجودة في "SAMP. Inf" وانقر على أخذ عينات العينة. ثم ، انقر فوق شريط الأدوات وحدد إشارة صغيرة.</li>
		<li>انقر فوق وقت التسجيل لجمع البيانات ، والتي ستنتقل تلقائيا إلى المخزن المؤقت عند الانتهاء. احفظ البيانات في ملف Naf وانقر فوق نموذج إلغاء التحميل.</li>
		<li>ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة وتفريغ العينة بعد 1 دقيقة. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.</li>
		<li>تحقق من معلومات العينة كما هو موضح سابقا في الخطوات 4.2.17-4.2.20 ؛ قم بتغيير PBS (الخطوة 4.2.17) إلى عينة sEV وتحليل البيانات.</li>
	</ol></li>
	<li>مزيد من تحديد sEVs بواسطة لطخة الغربية.<ol><li>تحديد تركيزات البروتين من sEVs والأنسجة باستخدام مجموعة قياس كمية البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.</li>
		<li>احسب حجم تحميل sEVs (على سبيل المثال ، ل 5 ميكروغرام من البروتين لكل بئر) بناء على هذه النتائج الكمية. أضف مخزن التحميل بنسبة 1: 4 ودوامة الخليط.</li>
		<li>بعد تغيير الطبيعة في حمام معدني 100 درجة مئوية (ترموستات جاف) لمدة 10 دقائق ، افصل البروتين على جل بولي أكريلاميد 12٪ عند 60 فولت لمدة 80 دقيقة.</li>
		<li>انقل الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين 0.22 ميكرومتر عند 220 مللي أمبير لمدة ساعتين باستخدام مخزن النقل المؤقت (25 مللي متر تريس ، 192 مللي مول جليكاين ، 20٪ ميثانول).</li>
		<li>سد الغشاء ب 5٪ حليب جاف منزوع الدسم في Tween محلول ملحي مخزن من Tris (TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة واحتضانه بالجسم المضاد الأساسي (الجسم المضاد CD9 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد CD63 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد TSG101 أحادي النسيلة للأرانب ، الجسم المضاد GM130 أحادي النسيلة للفأر) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ حليب خالي الدسم في 1: 1000.</li>
		<li>بعد ثلاث غسلات مع TBST ، احتضان الغشاء مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.</li>
		<li>اكتشف الجسم المضاد المرتبط ب HRP باستخدام ركيزة نشاف ECL ، ثم اجمع الصور وحللها.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم الحصول على sEVs عالية الجودة عن طريق عزل الأنسجة الحادة ، والعلاج بالإنزيمات الهضمية ، والطرد المركزي التفاضلي ، وترشيح وتنقية غشاء المرشح 0.22 ميكرومتر. بالنسبة لتحليل المصب ، من المهم للغاية ضمان النقاء العالي للمركبات الكهربائية الكهربائية. في عملية الطرد المركزي التفاضلي ، ستظهر طبقة من المواد البيضاء (تكوين غير معروف) على سطح المادة الطافية. نظرا لأن هذه الطبقة من شأنها أن تلوث المركبات الكهربائية ، فقد قمنا بإزالتها قدر الإمكان عن طريق ا...

يبلغ قطر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) حوالي 30 نانومتر إلى 150 نانومتر وتفرزها خلايا مختلفة1. يمكنهم التواصل مع خلايا الأنسجة وتنظيم البيئة المكروية المحلية أو البعيدة عن طريق نقل جزيئات بيولوجية مهمة مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة والخلايا والأجزاء داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكنهم أيضا تغيير سلوك الخلايا المتلقية 2,3. يعد عزل وتنقية sEVs المحددة شرطا أساسيا لدراسة سلوكها البيولوجي أثناء تطور المرض ومساره. يستخدم الطرد المركزي التفاضلي - الذي يعتبر المعيار الذهبي - بشكل شائع لفصل sEVs عن الأنسجة التي يقيمون فيها عادة4. يمكن إزالة حطام الأنسجة وحطام الخلايا والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج بواسطة هذه التقنية ، مع ترك sEVs فقط.
لقد ثبت أن كولاجيناز D و DNase I لا يؤثران على الخصائص الجزيئية للخلايا أو الحويصلات ، حيث تساهم خصائص كلا الإنزيمين في إطلاق الحويصلات في المصفوفة خارج الخلية 5. تم استخدام هذه الإنزيمات لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الجلد النقيلي البشري ، وأنسجة سرطان القولون ، والأنسجة المخاطية القولونية5،6،7. ومع ذلك ، فإن تركيز ووقت هضم كولاجيناز D و DNase I في هذه الطرق يختلفان ، مما يؤدي إلى استنتاجات غير متسقة. لتجنب الترسيب المشترك لأنواع فرعية أخرى من sEVs ، قام الباحثون بإزالة حويصلات أكبر خارج الخلية (قطرها 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر) عن طريق الترشيح و / أو الطرد المركزي التفاضلي8. اعتمادا على الأنسجة المصدر ، قد تكون هناك حاجة إلى طرق مختلفة للعزل والتنقية 9,10.
يؤدي استخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي التقليدي لاستخراج sEVs من أنسجة الكبد إلى طبقة من المادة البيضاء على سطح المادة الطافية ، دون أي طريقة لتحديد خصائصها. في دراسة سابقة11 ، وجد أن هذه الطبقة من المادة البيضاء تؤثر على نقاء sEVs. على الرغم من أن عدد الجسيمات وتركيز البروتين للعينات المعزولة بالطريقة التقليدية كانا أعلى من تلك الموجودة في الطريقة الحالية ، إلا أن معامل الاختلاف كان كبيرا ، ربما لأن العديد من الملوثات يمكن أن تؤدي إلى ضعف تكرار النتائج. أي باستخدام المنظفات (أي اكتشاف قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100) ، وجدنا أن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة كان أكبر. ومن ثم ، فإننا نستخدم هذه الطريقة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم للبحث البروتيني.
في الوقت الحاضر ، تركز الأبحاث حول sEVs في سرطان الكبد بشكل أساسي على المصل والبلازما والمادة الطافية لثقافة الخلايا12،13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تعكس sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بشكل أكثر دقة علم الأمراض الفسيولوجية والبيئة المكروية المحيطة بسرطان الكبد وتتجنب بشكل فعال تدهور وتلوث المركبات الكهربائية الأخرى15,16. مع استخدام الطرد المركزي التفاضلي ، يمكن لهذه الطريقة إثراء الغلة والحصول على sEVs عالية الجودة ، مما يوفر أساسا مهما لمزيد من الدراسة لسرطان الكبد. تتيح هذه الطريقة فصل أنسجة سرطان الكبد عن طريق الفصل الحاد وفصلها عن طريق كولاجيناز D و DNase I. بعد ذلك ، تتم إزالة الحطام الخلوي والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج عن طريق الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. أخيرا ، يتم عزل sEVs وتنقيتها للدراسات اللاحقة.

<table><tbody><tr><td>0.22 وميكرو ؛ م وحدة تصفية الغشاء</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 مل حقنة معقمة</td><td>شركة هوبى Xianming للأدوات الطبية</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr>2٪ علوم <td>المجهر</td><td>الإلكتروني خلات اليورانيل</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 مل أنبوب الطرد</td><td>المركزي بيكمان كولتر</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6 آبار لوحة قطع</td><td>الخلية LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 مل دورق</td><td>تيانجين كانغي هينغ شركة مبيعات الأدوات التجريبية</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 & م مصفاة خلية</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 مم طبق ثقافة الخلية</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 & micro ؛ L أنبوب الطرد المركزي</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة قياس البروتين BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 الأجسام المضادة</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 الأجسام المضادة</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>جهاز الطرد المركزي 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>محلول التنظيف</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>شبكة النحاس</td><td>شركة Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>ترموستات جاف</td><td>Hangzhou allsheng Instruments</td><td>Company AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC الأجسام المضادة للجسم المضاد للإنسان CD9</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>بيروكسيداز الفجل الحار للماعز (HRP) مقترن بالأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر &nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>بيروكسيداز الفجل الحار الماعز (HRP) مقترن بالأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب &nbsp ؛</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>شنغهاي Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr> مقياس <tr><td>تدفق الجسيمات النانوية</td><td>NanoFCM INC</td><td>مثبطات</td> الفوسفاتيز FNAN30E20112368 <td></td></tr><tr><td>(PhosSTOP) Roche</td><td></td> <td>4906845001</td><td></td></tr> محلول <tr><td>ملحي مخزن (PBS) Servicebio</td><td></td> <td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Beads</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 الصناعات البيولوجية الأساسية المتوسطة</td><td>&nbsp;</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>مشرط</td><td>قوانغتشو Kehua شركة التجارة</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>كرات السيليكا النانوية</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>نقل إزالة اللون شاكر TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>مجهر إلكتروني ناقل</td><td>الحركة Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 الأجسام المضادة</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td>قوانغتشو Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

يمكن أن تعكس الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) المشتقة من الأنسجة الحالة الوظيفية للخلايا المصدر وخصائص الفضاء الخلالي للنسيج. يعد الإثراء الفعال لهذه المركبات الكهربائية شرطا أساسيا مهما لدراسة وظيفتها البيولوجية ومفتاحا لتطوير تقنيات الكشف السريري وتكنولوجيا الناقل العلاجي. من الصعب عزل sEVs عن الأنسجة لأنها عادة ما تكون ملوثة بشدة. توفر هذه الدراسة طريقة للإثراء السريع ل sEVs عالية الجودة من أنسجة سرطان الكبد. تتضمن الطريقة عملية من أربع خطوات: حضانة الإنزيمات الهاضمة (كولاجيناز D و DNase Ι) بالأنسجة ، والترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. نظرا لتحسين خطوة الطرد المركزي التفاضلي وإضافة خطوة ترشيح ، فإن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أعلى من تلك التي حققها الطرد المركزي التفاضلي الكلاسيكي. يوفر منهجية مهمة وبيانات داعمة لدراسة sEVs المشتقة من الأنسجة.

لعبت sEVs من أنسجة سرطان الكبد البشرية دورا حاسما في تشخيص وعلاج وتشخيص مرضى سرطان الكبد. استخدمت هذه الطريقة أدوات مخبرية شائعة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد. قد يوفر هذا دعما منهجيا لدراسة المركبات الكهربائية السريعة. يوضح الشكل 2 العملية العامة لإثراء sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم إطلاق sEVs في المساحات بين الخلايا للأنسجة بالكامل من خلال قطع الأنسجة والتحلل الأنزيمي. علاوة على ذلك ، يتم ترشيح المحلول الهضمي من خلال مرشحات 70 ميكرومتر لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة. علاوة ع...

هنا نصف إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال طريقة الطرد المركزي التفاضلي الأمثل.

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

تسمح هذه الطريقة بعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بنقاوة أعلى من تلك التي تحققها الطرد المركزي الكلاسيكي التفاضلي. هذه التقنية بسيطة ومريحة وسهلة التشغيل ، والتي يمكن أن توفر الدعم المنهجي لدراسة الحويصلات الصغيرة خارج الخلية. للبدء ، قم بإزالة عينة الأنسجة من الفريزر 80 درجة مئوية.ضع ما يقرب من 400 ملليغرام من الأنسجة في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج ، وفرم الأنسجة جيدا بمشرط. نقل الأنسجة إلى لوحة ستة آبار مع 1.5 ملليلتر من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، أو sEVs.بعد الحضانة ، ضع صفيحة الآبار الستة على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولترا من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل لإيقاف عملية الهضم. بعد ذلك ، انقل محلول الهضم إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر ، وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي حطام كبير للأنسجة.أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 500 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة حطام الأنسجة الصغيرة ، وجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي جديد 2 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي طاف في 3،000 غرام لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يوشك طرف الماصة على لمس الحطام الأبيض في الأسفل.بعد تكرار الطرد المركزي للسائل المتبقي ، قم بتجميع المادة الطافية في الأنبوب دون إزعاج الحطام. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها في 12،000 غرام لمدة 20 دقيقة ، ونقل 900 ميكرولتر من الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي 4.7 ملم. كرر الطرد المركزي للسائل المتبقي ، ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق.املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي طاف في 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS.بعد تكرار الطرد المركزي عند 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة ، أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS. نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد ، وقم بترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر. قم بتخزين المرشح عند 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs. تحقق من حجم محلول التنظيف. ثم لاحظ الفرق بين مستويات الغمد وسائل النفايات.بعد 20 ثانية من تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ، قم بتشغيل الكمبيوتر. انتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج. انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.بعد ذلك ، انقر فوق غمد فلو ، وحدد بدء التشغيل.ضع المياه فائقة النقاء على منصة التحميل. بعد أربع دقائق ، انقر فوق عينة وتعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل.انقر فوق عينة، وحدد تعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. ثم ضع الأنبوب الذي يحتوي على الماء عالي النقاء على منصة التحميل. في نفس الوقت ، انقر فوق عينة وتعزيز، متبوعا بتدفق غمد وتطهير.انقر فوق التشغيل اليدوي ، وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز لمدة دقيقة واحدة ، وفي نفس الوقت حدد 250 نانومتر مراقبة جودة الكريات النانوية السيليكا الفلورية القياسية في معلومات العينة. حدد أخذ العينات من عينة ، وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM.ثم ، انقر فوق أخذ العينات التلقائي ، وأدخل 1.0 في مجموعة أخذ العينات لإصلاح الضغط عند كيلو باسكال واحد. انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة كبيرة. اضبط الوضع الأفقي لليزر ، واضبط الليزر على ميكرومترين.ثم ، انقر باستمرار على L و R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة. انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. ثم احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ.ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل. انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز ، وبعد دقيقة واحدة انقر فوق عينة وتفريغ. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.ضع الأنبوب القياسي لحجم الجسيمات على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة لمدة دقيقة واحدة. حدد 68 إلى 155 S16M-Exo لمراقبة الجودة في معلومات العينة ، وانقر فوق عينة ، ثم أخذ العينات. بعد ذلك ، انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة صغيرة.انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ. بعد إزالة البقايا بمحلول التنظيف ، ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ، وقم بتنفيذ الخطوات الموضحة للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات.بعد ذلك ، قم بتنظيف الطرف الشعري كما هو موضح سابقا ، وقم بتحميل عينة sEV لتحليل البيانات الموضحة سابقا للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات. تم فحص sEVs المنقى تحت المجهر الإلكتروني النافذ ، والذي كشف عن وجود sEVs مع مورفولوجيا على شكل كوب. تم إجراء قياس التدفق الخلوي ل sEVs.وتراوح حجم الجسيمات من 40 إلى 200 نانومتر ، وكان متوسط حجم الجسيمات 89 نانومتر. تم العثور على نقاء sEVs المخصب ليكون 68.32٪ تم الكشف عن علامات البروتين من sEVs مثل CD63 و CD9 و TSG101 بواسطة اللطخة الغربية. تم استخدام GM130 كعلامة تحكم سلبية ل sEVs ، والتي تم العثور عليها في خلايا الأنسجة ولكن ليس في sEVs.من الأهمية بمكان تنفيذ خطوات الهضم الأنزيمي ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح الغشائي بعناية فائقة لضمان نقاء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية.

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يمكن استخدام الإكسوزومات المعزولة بالبلازما كطريقة غير جراحية وقابلة للتكرار للكشف عن المؤشرات الحيوية ومتابعتها للكشف المبكر وتطور المرض. يصف هذا الفيديو بروتوكول فصل الإكسوسومات عن عينات البلازما لمرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة ، والتي يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي والبروتين.

عزل الإكسوسوم: تقنية لفصل الإكسوسومات عن بلازما مرضى سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة

هذا هو بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة (EVs) من الكبد. يصف البروتوكول عملية من خطوتين تنطوي على التسريب الكولاجيني تليها تفاضلية ultracentrifugation لعزل أنسجة الكبد EVs.

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

اكسوسومي جيل جديد من حاملات تسليم المخدرات. وأنشأنا بروتوكولا عزلة اكسوسومي مع عالية الغلة والنقاء لتسليم siRNA. ونحن أيضا مغلفة المسمى فلوريسسينتلي غير محددة siRNA في اكسوسوميس والتحقيق استيعاب الخلوية لتحميل siRNA اكسوسوميس في الخلايا السرطانية.

إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) من الأنسجة كاملة، بما في ذلك عينات المخ والورم. ويوفر هذا الأسلوب أسلوب استنساخه لاستخراج المركبات الكهربائية من الأنسجة الصلبة للمزيد من التحليلات المتلقين للمعلومات.

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة مع التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين.

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الحويصلات الجذعية الصغيرة خارج الخلية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري (hUC-MSC-sEVs) باستخدام إعداد بسيط على نطاق المختبر. يتميز توزيع الحجم وتركيز البروتين وعلامات sEVs ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي.

طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية

يصف هذا البروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية (exosomes و microvesicles) من MSCs البشرية المستزرعة. يتم شرح المزيد من التطبيقات لهذه المركبات الكهربائية أيضا في هذه المقالة.

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.

عزل الحويصلات خارج الخلية ذات المحتوى المنخفض من السموم الداخلية المشتقة من خطوط الخلايا السرطانية

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الإكسوسومات المشتقة من طحال الفأر باستخدام مزيج من الهضم مع الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي الفائق.

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

يصف هذا البروتوكول عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلات الهيكل العظمي والنخاع العظمي للفئران باستخدام الهضم الإنزيمي والكروماتوغرافيا بإزالة الحجم، مما يتيح استعادة الكسور الغنية بالحويصلات من أنسجة بنية معقدة منخفضة الإنتاج لتحليل جزيئي لاحق.

عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلة الهياكل العظمية في الفأر ونخاع العظم بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

تعلم طريقة الطرد المركزي التفاضلي المحسّنة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من أنسجة سرطان الكبد بدرجة نقاء أعلى من الطرق التقليدية. هذه التقنية البسيطة تدعم أبحاث الأحياء السرطانية.

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

استكشف المزيد من الفيديوهات