عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة

يعد بروتوكول تنشيط وتوسيع الفقاعات الدقيقة مهما لأنه يلبي حاجة رئيسية غير ملباة في أبحاث العلاج بالخلايا وتصنيعها ، مما يحسن استمرار وفعالية علاجات الخلايا التائية. تحد تقنية الاختيار الإيجابي والتنشيط والتوسع القائمة على الطفو في Akadeum من التحفيز المفرط واستنفاد الخلايا التائية اللاحق أثناء سير عمل التنشيط والتوسع. للبدء ، احتضان 3 مرات 10 إلى 8th PBMCs التي تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 ملليلتر من عازلة الفصل ، مع الأجسام المضادة المضادة ل CD3 البيوتينيل.

امزج المكونات برفق عن طريق السحب ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف فقاعات أفيدين مجردة إلى الخلايا بنسبة 0.5 إلى 1 ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. واخلط باستخدام دوار تجاري من طرف إلى طرف عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

جهاز طرد مركزي عند 400 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا المختارة إيجابيا في الجزء العلوي من التعليق مع فقاعات أفيدين الدقيقة المجردة ، وستكون الخلايا المتبقية غير المختارة في حبيبات الخلية في أسفل الأنبوب. باستخدام ماصة زجاجية مقاس 9 بوصات ، أدخل الطرف أسفل طبقة خلية الفقاعة في أسفل الأنبوب.

نضح بيليه الخلية و subnatant مع ماصة إلكترونية ، ونقلها إلى أنبوب جديد. أعد تعليق طبقة الخلية الفقاعية المتبقية في الأنبوب الأصلي في ملليلتر واحد من وسط الخلايا التائية الكامل. جهاز طرد مركزي للمادة الفرعية عند 400 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستخدمها للقياس غير المباشر للنقاء والاسترداد.

بعد الطرد المركزي للخلايا الفرعية وغير المختارة ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسائط قبل العد. باستخدام عداد الخلايا الآلي ، قم بحساب الخلايا الموجودة في subnatant باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع وحدد عدد الخلايا التي تم التقاطها في طبقة خلية الفقاعة ، كما هو موضح في مخطوطة النص. لإنشاء أفيدين وفقاعات دقيقة مترافقة مضادة ل CD28 ، أضف الجسم المضاد المضاد ل CD28 البيوتينيل إلى الفقاعات الدقيقة التجارية ، واخلطه باستخدام الدوران من طرف إلى طرف لمدة لا تقل عن ساعتين.

أضف فقاعات أفيدين الصغيرة المضادة ل CD28 إلى تعليق خلية الفقاعة المحضرة بنسبة 1.5 إلى 1. امزج المكونات باستخدام الدوران من طرف إلى طرف لمدة 15 دقيقة. ثم اضبط الحجم الإجمالي إلى 2 مليون خلية لكل ملليلتر مع وسيط خلية T كامل ، أو وسيط آخر مرغوب فيه وفقا لرقم الخلية الذي تم الحصول عليه.

قم بتوزيع ملليلتر واحد من الخلايا المنشطة في لوحة 24 بئر ، واحتضانها في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، أضف IL-2 ومضاد CD3 القابل للذوبان لتشجيع المزيد من التوسع ، كما تم حسابه باستخدام العدد الأولي للخلايا المطلية في اليوم صفر. ضع لوحة الخلية مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

قم بإزالة نصف الوسط من الوسط كل يومين. استبدله بوسط خلية تائية جديد وكامل ، وأضف IL-2 بتركيز 50 وحدة لكل ملليلتر. عد الخلايا التائية مرتين أسبوعيا لتقييم كثافة الخلايا.

عندما تتجاوز كثافة الخلية 2 في 10 أس 6 ، أو 2.5 في 10 أس 6 خلايا لكل مليلتر ، قم بنقلها إلى وعاء أكبر ، وتخفيفها إلى 5 في 10 إلى 5 خلايا لكل ملليلتر. امزج محتويات كل بئر برفق عن طريق سحب لأعلى ولأسفل. قم بإزالة محتويات البئر بالكامل ، بما في ذلك الفقاعات الدقيقة ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

اغسل كل بئر ب 400 ميكرولتر من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ، وانقل المحلول إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح الطاف, وإعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من عازلة الفصل.

بعد ذلك ، قم بتقسيم 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى 25 ميكرولتر لكل منها للتنشيط والإرهاق. وصمة عار الخلايا مع كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة التنشيط والاستنفاد ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف ملليلتر واحد من عازلة الفصل ، واخلطه برفق ، وأجهزة الطرد المركزي لغسل الأجسام المضادة الزائدة.

نضح الطافية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل ، وانقلها إلى وعاء مناسب لتحليل قياس التدفق الخلوي. لوحظت زيادات في أعداد الخلايا التائية القابلة للحياة والخلايا التائية الإيجابية لجين التحوير بين عينة التحكم والخلايا التي تلقت التحفيز المشترك للفقاعات الدقيقة.

كما لوحظت زيادة في أعداد الخلايا المستجيبة في عينات الفقاعات الدقيقة. تعبر الخلايا التائية المنشطة القابلة للحياة عن زيادة علامة التنشيط المبكر CD69 ، وعلامة التنشيط المتوسطة إلى المتأخرة CD25. كان العدد الإجمالي والنسبة المئوية لعلامات الإرهاق PD1 الإيجابية أعلى أيضا بشكل ملحوظ في عينات الخلايا التي تلقت التحفيز المشترك للفقاعات الدقيقة.

يعد الخلط والتوزيع المناسبين للفقاعات الدقيقة أمرا ضروريا لضمان الجرعات الدقيقة ، حيث تطفو الفقاعات الدقيقة على السطح بسرعة دون تحريك. نتوقع تماما أن تفعل ذلك من خلال تمكين النمو السريع لعدد كبير من الخلايا التائية ذات النشاط العالي من تلك الخلايا التائية الأكثر استنفادا التي تظهر بشكل متكرر في طرق أخرى.