التجزئة تحت الخلوية لعزل المكونات المتشابكة من دماغ الفئران
September 14th, 2022
يقدم هذا البروتوكول طريقة قوية ومفصلة للحصول على تشابك عصبي عالي النقاء ، وحويصلات متشابكة ، وكسور متشابكة أخرى من دماغ الفأر. تتيح هذه الطريقة تقييم العمليات المشبكية ، بما في ذلك التحليل الكيميائي الحيوي لتوطين البروتين ووظيفته بدقة مجزأة.
المشابك العصبية هي الوحدات الحسابية الأساسية للدماغ. الطريقة المقدمة هي أداة بسيطة وقيمة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي وعملياتها الجزيئية وأيضا لفهم كيف يمكن تغييرها في اضطرابات الدماغ المختلفة. تتضمن هذه التقنية تجزئة هياكل متشابكة معزولة عن الدماغ.
وهذا يمكن الباحث من التقاط التأثيرات التي قد تكون مجزأة في المشبك. يمكن أيضا تحليل مستويات التوزيع ونشاط بروتينات معينة بدقة دون المشبكي. يستغرق هذا الإجراء حوالي 11 ساعة حتى يكتمل الباحث الفردي إذا سارت الأمور بسلاسة.
قد يواجه الفرد الذي لم يقم بهذه التقنية مطلقا صعوبة في طول هذا الإجراء لأنه سيستغرق بطبيعة الحال وقتا أطول قليلا لشخص غير معتاد على الخطوات. نظرا لطول هذا اليوم التجريبي ، نوصي بشدة بإجراء التشريح مع شريك يمكنه مساعدتك في تسهيل جمع الأنسجة بسرعة لضمان عدم وضع عينات على الثلج لفترة أطول من اللازم. نوصي أيضا بإعداد مخازن مؤقتة ومواد على مقاعد البدلاء في اليوم السابق لإجراء هذه التجربة بحيث يكون كل شيء في متناول اليد عند الحاجة.
هذا ينطبق بشكل خاص على أنابيب التجميع. سيتم جمع حصص متعددة لما مجموعه 11 كسرا تحت خلوي بنهاية هذا الإجراء. لذا فإن وضع علامة واضحة على هذه الأنابيب في وقت مبكر سيجعل يومك أسهل بكثير.
للبدء ، أدخل مقصا دقيقا تحت الجلد عند شق قطع الرأس إلى عمق حول الجمجمة وقم بعمل شق سهمي متوسط يصل إلى خياطة الأنف لسحب فروة الرأس من الجمجمة. من خلال العمل من المنطقة القذالية باتجاه كل جانب صدغي ، قم بقص اللفافة والعضلات لكشف السطح الخارجي للجمجمة خارج كل صماخ صوتي خارجي. قم بتأمين فروة الرأس والجانب المنبر من الجمجمة باليد غير المهيمنة ومن ناحية أخرى ، أدخل مقصا دقيقا بمقدار ملليمترين في الجانب الذيلي من الثقبة العظمى حيث يمكن رؤية الحبل الشوكي للخروج.
قم بعمل شق في خط الوسط حتى يصل المقص إلى السطح الداخلي للعظم داخل الجداري. قم بتغيير زاوية المقص بحيث تعمل الشفرات بالتوازي مع السطح الظهري للجمجمة. استمر في تقدم الشق السهمي المتوسط بشكل دائري عبر العظام الجدارية والأمامية باستخدام الغرز السهمية والجبهية كدليل وقم بإنهاء الشق خارج الخيط الأنفي مباشرة.
بعد ذلك ، قم بعمل شق عمودي بثلاثة ملليمترات على عظم الأنف ، ومنبر على الخيط الأنفي ، عن طريق وضع المقص بشكل عمودي على الجمجمة مع وضع كل شفرة في خياطة الأنف قبل الفك العلوي وجعل واحدة مقطوعة. أثناء تأمين الجانب المنقاري ، استخدم جانبا واحدا من زوج من الملقط المحكم لرفع الجمجمة برفق من الدماغ ثم رفعها جانبيا وبطنيا. كرر على طول خط الوسط حسب الحاجة ، ثم لنصف الكرة الآخر حتى ينكشف سطح الدماغ بالكامل.
باستخدام ملقط منحني أو ملعقة دقيقة ارفع الجانب المنبر من الدماغ برفق. قطع الأعصاب البصرية والقحفية لإكمال الاستئصال من الجمجمة. تجانس العقول باستخدام خالط زجاجي يوضع على حمام جليدي في 12 تمريرة لأعلى لأسفل عند 500 دورة في الدقيقة.
توقف لفترة وجيزة عند كل ضربة لأسفل لضمان التجانس الشامل للأنسجة. نقل التجانس الكلي للدماغ إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع عالي السرعة 14 ملليلتر وقم بتدويره عند 800 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على المادة الطافية المسماة S1.نقل S1 إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وتجاهل الحبيبات. خذ اثنين من خمسة ميكرولتر من S1 لمقايسة حمض البيسينشونينيك واثنين من 100 ميكرولتر من S1 للوصمة الغربية.
تدور S1 في 9،000 G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية للحصول على طاف سومي متشابك ، أو S2 ، وبيليه متشابك خام أو P2. خذ اثنين ، 10 قلص ميكرولتر من S2 لمقايسة حمض البيسينشونينيك واثنين من 500 ميكرولتر من S2 للوصمة الغربية. تخلص من المادة الطافية بعد الحصول على القسمة الألي. بعد الطرد المركزي عند 9،000 G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، احصل على الطافي S2'وغسل المشبك ، P2'تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق P2'في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت A.تجنب إعادة تعليق الجزء الأحمر الداكن في الجزء السفلي من الحبيبات ، والذي يحتوي بشكل أساسي على الميتوكوندريا.
خذ اثنين من القسمة 20 ميكرولتر من P2'لمقايسة حمض البيسينتشونينيك واثنين من القسمة 100 ميكرولتر من P2'للوصمة الغربية. بالنسبة للتحلل منخفض التوتر للتشابك المغسول ، أضف تسعة مجلدات من المخزن المؤقت المبرد B لإعادة تعليق P2'وتجانس المشبكي في مجانس زجاجي أسفل. نقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية مغطاة بسعة 50 ملليلتر وتدويرها على مسدس أنبوب في غرفة باردة تبلغ درجة حرارتها أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
جهاز طرد مركزي P2'at 25 ، 000 G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية للحصول على طاف التحلل أو LS1 ، وحبيبات التحلل التي تحتوي على أغشية متشابكة ، أو LP1. خذ اثنين ، 50 ميكرولتر من LS1 لمقايسة حمض البيسينشونينيك واثنين من القسمة 400 ميكرولتر من LS1 للوصمة الغربية. انقل LS1 إلى أنبوب طرد مركزي مغطى للطرد المركزي الفائق.
جهاز طرد مركزي LS1 في دوار طرد مركزي فائق الزاوية ثابتة عند 100،000 G لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية للحصول على طافية السيتوسول المشبكي ، أو LS2 ، وبيليه الحويصلة المشبكية ، أو LP2. أعد تعليق LP2 في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت A وباستخدام إبرة قياس 23 وحقنة ملليلتر واحد LP مع تثليج لطيف. خذ اثنين ، 10 قلمة ميكرولتر من LP2 لمقايسة حمض البيسينشونينيك واثنين ، 250 ميكرولتر من LP2 للوصمة الغربية.
انقل حوالي 30 ملليلتر من LS2 إلى وحدات تصفية الطرد المركزي مع قطع 10 مللي دالتون وركز LS2 على حوالي 0.5 ملليلتر عن طريق الدوران عند 5،000 جم لمدة تصل إلى ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. خذ اثنين ، 10 قلص ميكرولتر من LS2 المركز للمقايسة bicinchoninic ، واثنين ، 250 قلمة ميكرولتر من LS2 المركزة للطخة الغربية. أعد تعليق LP1 في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت B ، وخذ اثنين ، 10 ميكرولتر من LP1 لمقايسة حمض البيسينتشونينيك واثنين من حصص 50 ميكرولتر من LP1 للوصمة الغربية.
اضبط LP1 المتبقي على الحجم النهائي 7.5 ملليلتر ، وتركيز السكروز النهائي 1.1 مولار مع المخزن المؤقت B والمخزن المؤقت C.ثم انقل 7.5 ملليلتر من LP1 المعاد تعليقه إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 14 ملليلتر. تراكب بعناية LP1 مع 3.75 ملليلتر من المخزن المؤقت D ووضع علامة على الجزء العلوي من الحل بقلم. ثم تراكب مع حوالي 1.25 ملليلتر من المخزن المؤقت A.وبالمثل ضع علامة على الجزء العلوي من الحل بقلم.
قم بموازنة الأنابيب للطرد المركزي الفائق بالوزن وليس الحجم ، مع إضافة المخزن المؤقت A إلى 10 ملليغرام. جهاز طرد مركزي عند 48،000 G لمدة 2.5 ساعة عند أربع درجات مئوية في دلو متأرجح دوار الطرد المركزي الفائق والحصول على صور للتدرجات السليمة لتوثيق تميز كل واجهة سكروز ونجاح التجزئة. قم بإزالة الطبقة السطحية من السكروز 320 ملي مولار بعناية واستعد جزء المايلين عند واجهة السكروز 320 ملي مولار و 855 مليمولار في حجم 800 ميكرولتر.
ماصة لأعلى من جدار الأنابيب بطريقة دائرية لضمان جمع الكسر الكامل. ثم استرجع جزء SPM عند واجهة السكروز 855 ملي مولار و 1.1 مليمولار في حجم 1000 ميكرولتر. استنشاق بعناية من السكروز المتبقي واستعادة بيليه الميتوكوندريا عن طريق تعليق 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت B.تمييع جزء SPM مع مجلدين من المخزن المؤقت B ، ثم أجهزة الطرد المركزي في دوار بزاوية ثابتة في أنبوب طرد مركزي 3.5 ملليلتر.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات SPM في المخزن المؤقت A للحصول على حجم نهائي يبلغ 250 ميكرولتر. خذ اثنين أو خمسة ميكرولتر من حصة SPM لفحص حمض البيسينشونيك وقسم SPM المتبقي إلى نصفين للطخة الغربية. يتم عرض صور المجهر الإلكتروني للتشابك العصبي في هذا الشكل.
يوضح هنا متشابك عصبي يحتوي على حويصلات متشابكة مكونات قبل وبعد المشبكية وحويصلات متشابكة في الميتوكوندريا. تم إجراء تحليل اللطخة المناعية للكسور تحت الخلوية لتقييم علامات نقاء الكسور. عند مقارنتها بتجانس الدماغ الكامل الأولي ، كشف التحليل عن إثراء n-cadherin في جزء غشاء البلازما المشبكي ، و alpha synuclein في العصارة الخلوية المشبكية ، و synaptophysin في جزء الحويصلة المشبكية ، والبروتين الأساسي للمايلين في جزء المايلين.
بمجرد تحديد نقاء الكسر ، يمكن استخدام النشاف المناعي الكمي لتحديد توطين البروتينات ذات الأهمية ، أو الاستعلام عن الاختلافات في توزيع البروتين بين الأنماط الجينية أو العلاجات. عند محاولة هذا الإجراء ، تأكد من استخدام الأواني الزجاجية الخالية من المنظفات بحيث يمكن جمع المشبكي السليم. كن حذرا أيضا أثناء تحضير تدرجات السكروز لضمان حصولك على واجهات واضحة.
سيسمح لك ذلك بعزل جزء غشاء البلازما المشبكي بنجاح. يمكن إجراء تحليل هيكلي ووظيفي مختلف للمساعدة في جودة الكسور المشبكية مثل المجهر الإلكتروني ، والنشاف المناعي ، والبروتينات ، والطرق الجزيئية الأخرى. يمكن أيضا إجراء إطلاق الناقل العصبي أو المقايسات الأنزيمية للمساعدة في الصلاحية الأيضية للتشابك.
كان عزل الهياكل المشبك تقنية تحويل النموذج لتحليل وظيفة المشبك وتكوينه. كما نرى الخلل الوظيفي المشبكي المبكر في التنكس العصبي ، فإن التشريح الدقيق للتغيرات الجزيئية على مستوى المشبك سيساعدنا على استكشاف الآليات الجزيئية لهذه الاضطرابات.
نظرة عامة
تحدد هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لعزل الكسور المشبكية النقية، بما في ذلك المشبكونات والحويصلات المشبكية، من أنسجة دماغ الفأر. تساعد الطريقة في دراسة العمليات المشبكية، مما يسمح للباحثين بتحليل توطين البروتين ووظيفته على مستوى التقسيمات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا المشبكية
- التحليل الكيميائي الحيوي
الخلفية
- تعمل المشابك كوحدات أساسية في الحوسبة الدماغية.
- إن عزل الكسور المشبكية يسهل الدراسات الجزيئية التفصيلية.
- فهم التغيرات المشبكية أمر بالغ الأهمية للعديد من اضطرابات الدماغ.
- تسمح الطريقة بتحليل نشاط البروتين بشكل مجزأ.
غرض الدراسة
- توفير بروتوكول موثوق لعزل المشابك من دماغ الفأر.
- تمكين دراسة العمليات البيوكيميائية المشبكية ووظيفة البروتين.
- تعزيز فهم الخلل المشبكي في الظروف العصبية.
الطرق المستخدمة
- يتضمن البروتوكول تجزئة الهياكل المشبكية من عينات دماغ الفأر.
- يتطلب تشريحًا دقيقًا وتجانسًا لأنسجة الدماغ.
- تمتد الإجراء حوالي 11 ساعة، مع التركيز على الكفاءة في جمع الأنسجة.
- يتم جمع عدة أجزاء من الكسور تحت الخلوية للتحليل اللاحق.
- يوصى بتسمية أنابيب الجمع بعناية لتسهيل العملية.
النتائج الرئيسية
- تنتج الطريقة كسور مشبكية نقية للغاية مناسبة للتحليلات البيوكيميائية.
- يمكن إجراء تحليل توطين البروتين المحدد ونشاطه.
- تسهم النتائج في فهم أفضل للوظائف المشبكية والتغيرات في سياقات المرض.
الخلاصات
- يسهل هذا البروتوكول التدقيق الشامل للمكونات المشبكية.
- قد يساهم الفهم المعزز للآليات المشبكية في توجيه النهج العلاجية لاضطرابات الدماغ.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Subcellular fractionation of murine brain tissue enables precise isolation of synaptic compartments, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurobiology-focused drug discovery. This approach provides high-resolution biochemical access to synaptic subdomains, facilitating predictive confidence in early-stage neuroscience portfolios. The method is strategically positioned for elucidating molecular mechanisms underlying synaptic dysfunction relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of synaptic protein localization and distribution at sub-compartmental resolution.
- Supports functional target validation by isolating metabolically active synaptosomes for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing pre- and post-synaptic molecular changes.
- Provides a platform for comparative studies across genotypes or treatment conditions.
Screening & Assay Development
- Generates validated synaptic fractions for quantitative immunoblotting and proteomic assays.
- Ensures reproducibility and standardization through biochemical enrichment and electron microscopy validation.
- Enables preparation of assay-ready material for compound screening targeting synaptic function.
- Supports scalable workflows by producing multiple aliquots of distinct subcellular fractions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling synaptic dysfunction observed in neurological disorders.
- Enables translational biomarker discovery through compartment-specific protein analysis.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of synaptic targets.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying synaptic mechanisms of disease.
Pipeline & Workflow Integration
This fractionation protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in neuroscience R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on synaptic protein distribution and function.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready synaptic fractions for quantitative analysis.
- Analytics: Enables quantitative immunoblotting and electron microscopy for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant synaptic alterations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for synaptic fractionation across neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target studies.
- Operational Value: Standardizes subcellular fractionation and validation for reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying synaptic mechanisms and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of synaptic targets in neuropsychiatric and neurodegenerative pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomical dissection and subcellular fractionation techniques.
- Demands access to ultracentrifugation, electron microscopy, and immunoblotting infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for buffer preparation and sample handling.
- Adaptable to various murine models but sensitive to procedural timing and tissue integrity.
- Time-intensive protocol may challenge throughput for inexperienced personnel.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:37
Mouse Brain Excision
3:32
Synaptosome Preparation
5:23
Hypotonic Lysis
6:24
Synaptic Vesicle Isolation
7:35
Synaptic Plasma Membrane Isolation
10:02
Results: Electron Microscopy of Synaptosomes and Immunoblot Analysis of Subcellular Fractions
11:00
Conclusion
