استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في S. cerevisiae

من خلال مزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول ثم استنفاد البروتين المستهدف في مرحلة معينة، يمكن لهذه الطريقة تحديد وظائف مميزة مؤقتا لبروتينات معينة. يمنع استنفاد البروتينات المشروطة في مراحل محددة من العضل التأثيرات المتبقية التي يمكن أن يحدثها الطافر العضلي التقليدي في المراحل اللاحقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الانقسام الميتوزي الخميري الناشئ والكائنات الحية الأخرى التي لا تتعرض لانهيار الغلاف النووي.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة في الكائنات الحية الأخرى لدراسة أحداث دورة الخلية قبل انهيار الغلاف النووي. للبدء ، اصنع وسادة أجار سيتم استخدامها لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا للتصوير. قم بقطع وتجاهل الغطاء والثلث السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر لإنشاء أسطوانة تعمل كقالب لوسادة أجار.

ضع أسطوانة أنبوب الطرد المركزي الدقيقة المقطوعة على شريحة زجاجية نظيفة مع الجزء العلوي من الأنبوب رأسا على عقب ، جالسا على الشريحة. اصنع ستة ملليلتر من محلول أجار 5٪ في دورق سعة 50 ملليلتر. اقطع طرف الماصة لعمل فتحة أكبر وماصة حوالي 500 ميكرولتر من الآجار المذاب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

اتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يصلب الآجار. لتحضير خلايا الخميرة ، قم بتدوير 200 ميكرولتر من ثقافة الأبواغ عند 800 جم لمدة دقيقتين في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة ملليلتر. تجاهل 180 ميكرولتر من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية عن طريق تحريك الأنبوب ونفضه. ماصة ستة ميكرولتر من الخلايا المركزة على الغطاء تنزلق في منتصف الغرفة على الفور مع ConA. امسك الأسطوانة بوسادة أجار وحركها بعناية عن الشريحة الزجاجية.

تأكد من أن الآجار مسطح تماما في الأسفل وباستخدام الجزء السفلي من طرف الماصة ، ضع قدرا طفيفا من الضغط على قالب الطرد المركزي الدقيق بحيث يتم دفع وسادة الأجار للخارج قليلا فوق حدود الأنبوب. بعد ذلك ، اقلب القالب بحيث تكون وسادة أجار متجهة لأسفل نحو الغرفة. استخدم الملقط لوضع وسادة الآجار برفق فوق الخلايا وطرف الماصة لتحريك وسادة الأجار برفق حول الحجرة من 10 إلى 20 مرة لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا على زلة الغطاء.

احتفظ بوسادة أجار في الحجرة لمدة 12 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك ، انقل مليلتر من ثقافة الأبواغ إلى أنبوبين للطرد المركزي الدقيق وتدور عند 15،700 جم لمدة دقيقتين. بعد نقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة نظيفة ، قم بالدوران مرة أخرى في نفس الحالة واجمع المادة الطافية لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.

أضف ملليلتر من المادة الطافية بالتنقيط إلى الغرفة التي تحتوي على وسادة أجار. بمجرد وصول السائل إلى الجزء العلوي من الغرفة ، من المرجح أن تطفو وسادة أجار. قم بإزالة وسادة أجار برفق بالملقط وتخلص منها.

ضع زلة غطاء مقاس 24 × 50 ملم على الجزء العلوي من الحجرة لمنع التبخر أثناء التصوير. لإعداد الفيلم على المجهر، قم بتركيب زلة الغطاء داخل حامل الشريحة. قم بلصق طين التشكيل على جانب زلة الغطاء لإبقائه آمنا في حامل الانزلاق.

افتح برنامج الحصول على الصور. استخدم مقابض ضبط خشنة ودقيقة لتركيز الخلايا باستخدام DIC أو المجال الساطع. في القائمة الرئيسية لبرنامج الحصول على الصور ، انقر فوق ملف ، وحدد اكتساب ، وستظهر أربع نوافذ.

في النافذة المسماة Resolve 3D ، انقر فوق رمز قارورة Erlenmeyer. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة بعنوان Design Run Experiment ، والتي تحتوي على عناصر التحكم لإعداد تجربة لإعداد فيلم بفاصل زمني. ضمن علامة التبويب تصميم ، انتقل إلى علامة التبويب المسماة تقسيم.

حدد المربع بجوار التقسيم Z واضبط تباعد المقطع البصري على ميكرومتر واحد وعدد الأقسام البصرية على خمسة. بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب القنوات ، انقر فوق رمز علامة الجمع وحدد القناة المناسبة. ثم حدد المربع بجوار الصورة المرجعية واضبط الموضع Z على منتصف العينة من القائمة المنسدلة.

حدد قيمة النفاذية ووقت التعرض من القائمة المنسدلة. ضمن علامة التبويب الفاصل الزمني ، حدد المربع بجوار الفاصل الزمني وأدخل قيما للدقائق والساعات لتحديد الفاصل الزمني للحصول على الصورة. حدد المربع بجوار الحفاظ على التركيز مع التركيز البؤري النهائي لمنع انحراف المسرح أثناء الفيلم.

وتحت علامة التبويب النقاط ، حدد المربع بجوار قائمة نقاط الزيارة. في القائمة الرئيسية ، انقر فوق عرض وحدد قائمة النقاط. انقل المسرح إلى منطقة من الحجرة تظهر طبقة أحادية من الخلايا.

انقر فوق علامة النقطة في نافذة قائمة النقاط. حرك المسرح لتحديد 25 إلى 30 نقطة دون أي تداخل لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا وتصوير كل حقل خلال كل دورة زمنية. في نافذة قائمة النقاط، حدد معايرة الكل لتعيين التركيز البؤري النهائي لكل نقطة.

ضمن علامة التبويب "تشغيل" ، احفظ الملف إلى الوجهة المناسبة على الكمبيوتر. في نافذة تشغيل التجربة، حدد الزر تشغيل لبدء تشغيل الفيلم. افتح برنامج فيجي.

افتح قنوات DIC و mChery. احصل على إسقاط واحد بحد أقصى للكثافة لقناة mCherry بالنقر فوق صورة ، متبوعا ب Stacks و Z Project وحدد Max Intensity من القائمة المنسدلة. لدمج قنوات DIC و mCherry في صورة واحدة ، انقر فوق الصورة واللون وحدد دمج القنوات.

اتبع خلية واحدة من خلال الانقسام الاختزالي. بعد اكتمال الانقسام الميوزي الثاني، سجل عدد كتل الحمض النووي (DNA). في خلايا النوع البري ذات الخلفية المرساة البعيدة، توجد عادة أربع كتل من الحمض النووي (DNA) في نهاية الانقسام الميوزي الثاني، تمثل النواتج الأربعة للانقسام الميوزي.

في جزء صغير من الخلايا ، تظهر ثلاث كتل فقط بعد الانقسام الاختزالي الثاني.عندما يتم تثبيت Ctf19-FRB بعيدا في وقت إطلاق الطور الأولي ، فإن ما يقرب من 47٪ من الخلايا تعرض أكثر من أربع كتل من الحمض النووي عند الانتهاء من الانقسام الاختزالي ، مما يشير إلى وجود خلل في ارتباط الحركية والأنابيب الدقيقة. مع تثبيت Ctf19-FRB ، إما بعد تجميع كينيتوكور ولكن قبل الانقسام الاختزالي الأول ، أو بعد الانقسام الاختزالي الثاني ، ما يقرب من 16 ٪ من الخلايا تظهر كتل الحمض النووي إضافية. أحد أهم أجزاء هذا البروتوكول هو إضافة الطافت قطرة قطرة إلى غرفتك لتجنب تعطيل الطبقة الأحادية.

بالإضافة إلى ذلك ، لاحظ الوقت اللازم للتحضير للتصوير للنظر فيه في تحليلك. عن طريق تغيير البروتينات المعبأة بالفلورسنت ، يمكن استخدام هذا الإجراء للإجابة على الأسئلة المتعلقة بمدة دورة الخلية ، وفصل الكروموسومات ، ووفرة البروتين ، وتوطين البروتين.