تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية
أكتوبر 6, 2022
يصف البروتوكول الحالي طريقة تسمح بتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية على مجموعات محاقن Pseudomonas المزروعة داخل نبات apoplast.
يوفر بروتوكولنا طريقة لطيفة لتلقيح واستخراج النباتات تسمح باستعادة المجموعات البكتيرية المزروعة في أبوبلاست الأوراق المناسبة لتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية مثل قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة باستخراج كمية كبيرة من البكتيريا من apoplast دون تلويث العينات بشكل كبير بالحطام الخلوي للنبات. يمكن تطبيق هذه الطريقة المثلى لاستعادة البكتيريا apoplastic مباشرة أو مع تعديلات طفيفة على عدد من الأنظمة البكتيرية النباتية التي تضم إما البكتيريا المسببة للأمراض النباتية أو البكتيريا الداخلية المفيدة.
سيكون عرض الإجراء نيفيس لوبيز باغان ، طالب دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، املأ أصيصا بقطر 10 سم بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت 1: 3 الذي تم تسويته مسبقا. غطي الوعاء بشبكة معدنية مثقبة واضبط الشبكة المعدنية على التربة الرطبة باستخدام شريط مطاطي.
بعد ذلك ، زرع بذور Arabidopsis في ثقوب الشبكة المعدنية باستخدام مسواك مبلل. ضع ثلاث إلى أربع بذور في مواضع بعيدة داخل الأصيص. غطي الوعاء بقبة بلاستيكية للحفاظ على رطوبة نسبية عالية واحتضانه للتقسيم الطبقي عند أربع درجات مئوية لمدة 72 ساعة.
انقل الوعاء إلى غرفة نمو النبات في ظل ظروف يوم قصير. للكشف عن الوعاء ، قم بإزالة القبة البلاستيكية. بمجرد أن تنبت البذور ، استخدم الملقط لإزالة معظم الشتلات ، مع الاحتفاظ بشتلة واحدة في كل موضع من مواضع الوعاء.
ثم قم بإعداد نباتات الفاصوليا Phaseolus vulgaris عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطعة مبللة من منشفة ورقية ووضع بذور الفاصوليا فوقها. ختم طبق بتري بشريط جراحي واحتضانه عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. انقل البذور النابتة إلى وعاء قطره 10 سم مملوء بمزيج ركيزة نبات الفيرميكوليت الرطب 1: 3 واحتضانه في غرفة نمو النبات في ظل إعدادات يوم طويل.
قم بإخراج مخزون الجلسرين من سلالة Pseudomonas syringae ذات الأهمية من 80 درجة مئوية تحت الصفر في صفيحة LB مكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. كشط الكتلة الحيوية البكتيرية وإعادة تعليقها في خمسة ملليلتر من كلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولار.
قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر واضبطها على 0.1 بإضافة 10 مليمول من كلوريد المغنيسيوم. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية في كلوريد المغنيسيوم 10 مليمولار للحصول على تركيز لقاح نهائي يبلغ خمسة في 10 إلى CFU الخامس لكل ملليلتر. ثم قم بإعداد 200 ملليلتر من اللقاح لنباتات أرابيدوبسيس و 50 ملليلتر لنباتات الفاصوليا.
قبل التلقيح ، أضف الفاعل بالسطح Silwet L-77 إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ لتلقيح الفاصوليا و 0.01٪ ل Arabidopsis. لتسلل Arabidopsis ، ضع اثنين من العصي الخشبية لتشكيل X فوق القدر ووضع القدر متجها لأسفل فوق طبق بتري قطره 14 سم يحتوي على 200 مل من اللقاح. لتلقيح أوراق الفاصوليا ، أدخل النباتات ومحلول اللقاح في غرفة مفرغة وأدخل الورقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على اللقاح.
أعط نبضة 500 مليبار لمدة 30 ثانية للتسلل إلى الأوراق. استنزاف محلول اللقاح الزائد بقطعة من الورق وأعد الخطط إلى غرفة النمو المقابلة لها. بعد أربعة أيام من التلقيح ، قم بقطع الجزء الجوي من نبات Arabidopsis أو الورقة الملقحة من نبات الفاصوليا ووضعها في حقنة سعة 20 مل بدون إبرة.
بالنسبة لأوراق الفاصوليا ، لف الورقة على نفسها ، تاركا الوجه المحوري للخارج. أضف كمية كافية من الماء المقطر لتغطية الأنسجة. بعد ذلك ، أدخل المكبس الذي يحمل المحقنة في وضع رأسي وقم بإزالة الهواء الزائد وفقاعات الهواء داخل المحقنة عن طريق النقر برفق على البرميل حتى يقع كل الهواء بالقرب من الطرف ، وبعد إزالة الهواء ، قم بتغطية طرف برميل المحقنة بفيلم البارافين.
الآن اضغط بعناية على المكبس لتوليد ضغط إيجابي حتى يصبح النسيج أغمق. ثم اسحب المكبس لتوليد ضغط سلبي. قم بإزالة فيلم البارافين والمكبس واجمع السائل الذي يحتوي على البكتيريا المستخرجة من أبوبلاست.
لتحليل خلية واحدة ، قم بإعداد محلول أغاروز 1.5٪ في الماء المقطر. بمجرد الذوبان ، أضف حجما كافيا لملء الفراغ بين شريحتين مجهريتين موضوعتين جنبا إلى جنب وضع شريحة أخرى في الأعلى. دعهم يقودون لمدة 15 دقيقة وأزل الشريحة الموضوعة في الأعلى بعناية.
باستخدام شفرة ، قم بقطع وسادة الأغاروز إلى قطع خمسة ملليمترات في خمسة ملليمترات قبل الاستخدام. بالتوازي ، أجهزة الطرد المركزي ملليمتر واحد من البكتيريا المستخرجة من apoplast. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولترا من الماء لتركيز الخلايا.
ضع قطرة من الخلايا المركزة بحجم ميكرولتر على غطاء 0.17 ملم وقم بتغطية القطرة بقطعة من وسادة الأغاروز. تصور التحضير البكتيري تحت المجهر متحد البؤر لتحديد البكتيريا الفلورية الخضراء باستخدام ليزر معين. تحديد جميع البكتيريا باستخدام المجال الساطع ودمج كلا الحقلين.
لإجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي ، خذ حصة من معلقات البكتيريا المستخرجة من apoplast. تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي والحصول على 100،000 الأحداث. يتم مراقبة التعبير عن HRPL GFP بواسطة مضان GFP.
تظهر الرسوم البيانية للرسم النقطي توزيع شدة التألق ل GFP مقابل حجم الخلية في السكان ، بينما تظهر الرسوم البيانية شدة مضان GFP مقابل عدد الخلايا. كانت النسب المئوية ل hrpL ON أعلى من النسب المئوية المقابلة ل hrpL OFF. تظهر صور الفحص المجهري الفلوري مستويات غير متجانسة من GFP المرتبطة بالتعبير عن hrpL.
لوحظت البكتيريا التي تظهر مضان GFP منخفض أو معدوم. للحصول على أفضل النتائج ، كن لطيفا أثناء خطوات استخراج البكتيريا لتجنب إتلاف الأنسجة النباتية وبالتالي الحد من التلوث من المحتوى الخلوي للنبات. يمكن استخدام عينات البكتيريا التي تم الحصول عليها لأغراض أخرى حيث يكون الحد من تلوث النبات ميزة ، مثل استخراج الحمض النووي للتحليل الجيني البكتيري أو النسخي اللاحق.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتحليل التعبير الجيني لخلية واحدة لمجموعات Pseudomonas syringae داخل أبلاست النبات. تعمل الإجراء على تحسين استعادة مجموعات البكتيريا مع تقليل التلوث من حطام النبات.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- تفاعلات النبات والعامل الممرض
- علم البيئة الميكروبية في النظم النباتية
- تقنيات تحليل خلية واحدة
الخلفية
- أهمية دراسة التعبير الجيني البكتيري في النباتات.
- التحديات في عزل البكتيريا من الأنسجة النباتية.
- الحاجة إلى طرق استخراج خالية من التلوث.
الطرق المستخدمة
- استخراج البكتيريا من الأبلاست باستخدام طريقة تعتمد على المحقنة.
- استخدام Pseudomonas syringae ككائن حي النموذج.
- استخدام قياس انسيابية الخلايا لتحليل التعبير الجيني لخلية واحدة.
النتائج الرئيسية
- استعادة ناجحة للبكتيريا المناسبة لتحليل خلية واحدة.
- تحديد مستويات التعبير الجيني باستخدام توهج GFP.
- تبين قابلية تطبيق الطريقة على أنظمة بكتيرية نباتية أخرى.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة طريقة محسنة لدراسة التعبير الجيني البكتيري في النباتات.
- تساهم النتائج في فهم تفاعلات النبات والبكتيريا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Pseudomonas syringae gene expression within plant tissue enables precise interrogation of bacterial phenotypic heterogeneity during host colonization. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for plant-pathogen interaction studies, informing early discovery and translational research pipelines. The method's optimized extraction and analysis workflow enhances predictive confidence in functional genomics and microbial ecology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of bacterial gene expression heterogeneity in planta.
- Supports functional validation of virulence factors and stress response pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing subpopulation behaviors under host-induced stress.
- Improves predictive confidence for target prioritization in plant-microbe interaction studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated bacterial preparations suitable for quantitative flow cytometry and microscopy assays.
- Enables reproducible measurement of gene expression at the single-cell level.
- Supports assay standardization by minimizing plant-derived contamination in samples.
- Prepares biological systems for downstream screening of genetic or chemical perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling in situ analysis of bacterial gene expression.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in plant-microbe systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative single-cell data.
- Provides mechanistic insights relevant to disease-relevant plant models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation in plant-microbe research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of bacterial gene expression and pathway activity in host tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables robust statistical analysis of gene expression distributions and subpopulation dynamics.
- Translational Research: Connects single-cell bacterial phenotypes to plant disease outcomes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse plant-bacterial systems with minimal adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes extraction and analysis, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-microbe research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant handling, bacterial culture, and single-cell analysis techniques.
- Needs access to confocal microscopy and flow cytometry instrumentation for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of extraction and analysis protocols to ensure reproducibility.
- Adaptable to various plant and bacterial systems with empirical optimization of extraction steps.
- Sample integrity depends on gentle handling to minimize plant debris contamination, as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:54
Plant Preparation
2:14
Inoculation of Arabidopsis and Bean Plants
3:53
Extraction of Bacteria from the Apoplast
4:55
Single-Cell Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria
6:14
Results: Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria Obtained from Arabidopsis or Bean Leaves After Bacterial Inoculation
6:57
Conclusion
