إعادة تشكيل العمارة الخلوية ووظيفة الأنسجة الظهارية البشرية على رقاقة عضو مفتوحة
February 17th, 2023
يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.
غالبا ما تفشل طرق الاستزراع الانتشاري التقليدية في تلخيص البيئة المعقدة للأعضاء الحية ، مما يؤدي إلى فقدان العلامات والوظائف الخاصة بالأنسجة. لقد طورنا شريحة مفتوحة تجمع بين ثقافة الانتشار ومبدأ الموائع الدقيقة لتقليد البيئة المكروية للأنسجة الظهارية عن كثب. من خلال تضمين الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر ، تمثل الرقاقة المفتوحة بديلا أفضل بين الأنظمة المغلقة.
ستوضح العملية Adya Panchal اليوم ، وهي طالبة أبحاث في مختبري. للبدء ، أحضر الكواشف المطلوبة تحت خزانة السلامة البيولوجية على الجليد. زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة للحصول على التقاء 80٪ إلى 90٪ ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
بيليه الخلايا في 250g لمدة خمس دقائق عند 24 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر لكل من الثلج البارد 10X EMEM والمخزن المؤقت لإعادة البناء. امزج الخلايا عن طريق السحب وأضف 1،800 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المثلج.
بعد ذلك ، امزج محلول ما قبل الهلام على الجليد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات. قم بتحييد محلول ما قبل الهلام ب 18 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، واخلطه برفق عن طريق السحب ، ثم ماصة 150 ميكرولترا من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة مع تجنب الفقاعات. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء بملليلتر من الماء المقطر المزدوج المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لأداء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي ، ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المحايد قبل الهلام على السطح المزخرف لختم معقم مطبوع ثلاثي الأبعاد وأدخل الختم داخل الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل. قم بإزالة أي بقايا هيدروجيل قد تتسرب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط. قم بتجميع جميع رقائق البطاطس في أطباق بتري منفصلة مع غطاء أنبوب مخروطي مملوء بالماء كما هو موضح سابقا.
واحتضان جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 90 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أعد الرقائق مرة أخرى تحت خزانة السلامة الحيوية وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل. بمجرد أن تصل الخلايا المستزرعة إلى التقاء 80٪ إلى 90٪ ، قم بفصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحللة للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.
بعد التفكك ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة شظايا الخلية المناسبة كما هو موضح في المخطوطة. لزرع الخلية الظهارية ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي فائض من محلول الطلاء. بمجرد استنشاق وسط الشطف ، قم بزرع سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولترا من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعتين.
لإزالة الحطام الخلوي ، اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسيط زراعة الخلايا مرتين ، وقم بتحديث الوسط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل غلاف الرقاقة. بعد نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.
بعد ذلك ، قم بشفط كل الوسط من قناة الموائع الدقيقة العلوية برفق وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة واجهة الهواء والسائل ، أو ALI. ضع الشريحة المفتوحة على حامل الإسكان مرة أخرى في الحاضنة. أعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية واستأنف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
شطف غرفة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية ثم البذور 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية. اقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة. ضع الرقائق في أطباق بتري.
ضعها مرة أخرى في الحاضنة كما هو موضح سابقا واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف قناة الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي. ضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.
املأ خزان وسط الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت خزانة السلامة الحيوية. ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة من أحد طرفيها وبالمضخة التمعجية من الطرف الآخر. افحص وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.
بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية. يتم تصور سطح الهلام الدقيق مع الخلايا وبدونها. كشف التحليل النسيجي عن بشرة طبقية ناضجة متعددة الطبقات متباينة على الرقاقة.
أظهرت صورة المنظر العلوي لرقاقة الجلد وجود الخلايا الليفية داخل طبقة الجلد. أظهر PECAM-1 و VE-cadherin و von Willebrand تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المزروعة بشكل مشترك في رقاقة الجلد المفتوحة. أظهر MUC5AC ، ألفا وبيتا توبولين ، بروتين خلية الكلورو 16 ، p63 ، و ZO-1 تلطيخ الفلورسنت ظهارة مجرى الهواء الناضجة.
لوحظت أهداب الضرب والظهارة الطبقية الزائفة الناضجة المتمايزة على رقاقة مجرى الهواء المفتوحة. أظهر تلطيخ الفلورسنت من النوع الأول والنوع الثاني و E-cadherin وجود خلايا رئوية ناضجة على الرقاقة. كشف المجهر الإلكتروني عن وجود الزغابات الدقيقة والحويصلات الليزوزومية ، وهو دليل على النمط الظاهري السنخي الناضج.
أظهر التحليل النسيجي وجود خلايا حرشفية مسطحة تتفق مع النمط الظاهري من النوع الأول ، وخلايا شبيهة بالحصى مكعبة متماسكة مع النمط الظاهري من النوع الثاني ، والخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية. تم تأكيد وجود الخلايا المعوية والكأس الناضجة من خلال تلطيخ الميوسين 2 و E-cadherin. أكدت الخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية وجود ظهارة عمودية بسيطة.
يجب أن تكون جميع الكواشف باردة ويجب شطف أسطح الجل بشكل كاف للحصول على سطح مستو. من المهم إزالة أي خلايا وحطام غير ملتصق للحصول على التصاق متساو للخلايا وطبقة أحادية اللون مدمجة وجدار وعائي. يمكن استخدام نهج مماثل لتوليد أنواع أخرى من نماذج الأعضاء الظهارية ، مثل الأمعاء والرئة ، لتقييم كيفية تأثير أدوية معينة أو عوامل بيئية على توازن الأنسجة البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على وظيفة الحاجز الظهاري والأوعية الدموية.
مع سهولة الوصول إلى مرحلة الفعالية في حجرة السدى ، يمكن للبحث الآن إنشاء أنماط وجه محددة وإعادة إنتاج بنية الأنسجة الوظيفية ، مثل cryptviveoli ، والتي يصعب تحقيقها مع الأجهزة الأخرى.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول استخدام رقاقة عضو مفتوحة القمة مصممة لتأسيس ونضوج ثقافات الأعضاء على الرقائق من الأنسجة الأولية مثل الجلد، الحويصلات الهوائية، المسالك الهوائية، والأمعاء. يسمح بالتحقيق في واجهة النسيج البشري/اللحمي وواجهة المكانة الوعائية في المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- هندسة الأنسجة
الخلفية
- غالبًا ما تفشل طرق الثقافة التقليدية في تكرار البيئة المعقدة للأعضاء الحية.
- فقدان العلامات والوظائف المحددة للأنسجة أمر شائع في نماذج المختبر التقليدية.
- تجمع رقاقة العضو مفتوحة القمة بين ثقافة الانتشار ومبادئ الميكروفلويديك.
- إنها تحاكي البيئة المكروية للأنسجة الظهارية بشكل أكثر دقة.
غرض الدراسة
- تطوير بديل أفضل للأنظمة المغلقة لدراسة وظائف الأعضاء.
- إدراج الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الموجودة في الأعضاء الحية.
- توفير منصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة لواجهات الأعضاء.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا اللحمية المحددة للأنسجة حتى 80-90٪ من الكثافة.
- فصل الخلايا باستخدام التربسين أو الطرق الموصى بها الأخرى.
- استخدام رقاقة العضو مفتوحة القمة لتأسيس الثقافة.
- دمج الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية في الثقافة.
النتائج الرئيسية
- تدعم رقاقة العضو مفتوحة القمة بنجاح ثقافات الأعضاء كاملة السمك.
- تسمح بالحفاظ على العلامات والوظائف المحددة للأنسجة.
- تظهر محاكاة محسنة للبيئة المكروية في الجسم الحي.
- تسهيل دراسة التفاعلات بين الظهارية/اللحمية والوعائية.
الاستنتاجات
- تعتبر رقاقة العضو مفتوحة القمة أداة واعدة لأبحاث الأعضاء على الرقائق.
- تعزز فهم وظائف الأعضاء في المختبر.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا النموذج في تطبيقات طبية حيوية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The Open-Top Organ-Chip enables reconstitution of human epithelial tissue architecture and function, addressing the limitations of traditional 2D and animal models in predicting in vivo outcomes. This platform supports high-fidelity modeling of epithelial, stromal, and vascular interactions, enhancing predictive confidence for barrier function and tissue-specific responses. Its integration into discovery and preclinical workflows offers strategic value for target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epithelial barrier integrity and tissue-specific signaling pathways.
- Supports functional validation of therapeutic targets within multicellular human-relevant systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling epithelial/mesenchymal and vascular crosstalk.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible 3D platform for quantitative assessment of barrier function and transport properties.
- Standardizes assay conditions with controlled biochemical and biomechanical cues.
- Enables scalable preparation of validated tissue constructs for compound evaluation.
- Supports screening of drug effects on epithelial and vascular compartments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with human tissue complexity for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving tissue-specific phenotypes.
- Reduces translational risk by enabling molecular dissection of intercellular interactions in health and disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on human-relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
The Open-Top Organ-Chip fits within the continuum from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging gaps between in vitro and in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in multicellular human tissue constructs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for barrier function and cellular differentiation.
- Analytics: Enables histological, immunofluorescent, and functional readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems for biomarker alignment and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse epithelial organ models and applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of complex tissue models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing human-relevant data earlier.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated tissue responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, microfluidics, and tissue engineering.
- Demands access to biosafety cabinets, peristaltic pumps, and imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various epithelial organ systems with protocol modifications as supported by the source.
- Practical limitations include the need for cold reagents and precise handling to ensure tissue integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Preparation of Pre‐Gel Solution for the Stroma Equivalent
2:24
Surface Micropatterning
3:24
Seeding Epithelial Cells on the Stromal Equivalent
4:40
Establishing Air‐Liquid Interface (ALI)
5:32
Endothelial Cell Seeding
6:24
Reconnect the Chip to Flow
7:02
Results: Analysis of Human Epithelial Tissues on an Open‐Top Organ‐Chip
8:49
Conclusion
